急性缺氧大鼠水代謝紊亂的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　高原是我軍重要戰(zhàn)略方向。但是，高原環(huán)境特殊，嚴(yán)重影響部隊(duì)的戰(zhàn)斗力。如何從軍事斗爭(zhēng)的需要出發(fā)，做好急進(jìn)高原部隊(duì)的衛(wèi)生保障，是我軍高原醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容。
　　平原人進(jìn)入高原后，會(huì)出現(xiàn)急性高原病，包括高原肺水腫(High altitude pulmonaryedema，HAPE)、高原腦水腫(High altitude cerebral edema，HACE)和急性高原反應(yīng)(Acutemountain sicknes

2、s，AMS)。HAPE和HACE是機(jī)體水代謝紊亂的結(jié)果;對(duì)于AMS，有人認(rèn)為是輕度的高原腦水腫所致。不論是急性高原病患者還是進(jìn)入高原后的相對(duì)健康人，普遍存在著飲水減少、體重降低等現(xiàn)象。因此，急進(jìn)高原可引起機(jī)體以脫水或水腫為表現(xiàn)形式的水代謝紊亂。
　　參與大腦渴覺(jué)調(diào)節(jié)的神經(jīng)核團(tuán)很多。研究表明，前扣帶回皮層(Anterior cingulatecortex，ACC)是渴覺(jué)調(diào)節(jié)的高級(jí)中樞，而室周器官(Circumventricular

3、organs，CVOs)是渴覺(jué)信號(hào)的感知者和啟動(dòng)者。穹窿下器(Subfornical organ，SFO)位于CVOs的中央，周?chē)患罅垦芗懊}絡(luò)膜，且缺乏血腦屏障，易受氧分壓的影響。因此我們推測(cè)，SFO區(qū)的神經(jīng)元有可能直接感知氧分壓變化，進(jìn)而影響動(dòng)物的飲水行為。
　　研究發(fā)現(xiàn)，SFO神經(jīng)元上的辣椒素受體(transient receptor potential-vanilloids，TRPVs)是渴覺(jué)興奮產(chǎn)生的關(guān)鍵分子，主要包

4、括TRPV1和TRPV4。有人通過(guò)中樞注射TRPV4激動(dòng)劑，發(fā)現(xiàn)大鼠飲水量顯著降低。也有實(shí)驗(yàn)證明，TRPV4對(duì)低氧分壓十分敏感，是動(dòng)物缺氧性肺血管收縮的重要因素。我們推測(cè)，缺氧有可能直接激活SFO區(qū)神經(jīng)元上的TRPV4，導(dǎo)致大鼠飲水量減少。
　　人和動(dòng)物對(duì)高原缺氧環(huán)境的習(xí)服是在神經(jīng)體液的整體調(diào)控下完成的。除了神經(jīng)機(jī)制外，體液機(jī)制在缺氧大鼠飲水減少中可能也發(fā)揮著重要作用。文獻(xiàn)表明，Adropin是由Enho基因編碼的分泌型小分子蛋白

5、，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的物質(zhì)代謝，且中樞注射Adropin能顯著減少大鼠的飲水量。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中也觀察到缺氧大鼠血清中Adropin含量增高，因此，Adropin有可能是缺氧大鼠飲水量減少的體液機(jī)制之一。
　　中度缺氧時(shí)，機(jī)體以習(xí)服代償為主，但嚴(yán)重缺氧會(huì)引起血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)的損傷和通透性增高。BBB由血管內(nèi)皮細(xì)胞及其緊密連接、基膜及周?chē)男切湍z質(zhì)細(xì)胞足突、周細(xì)胞等結(jié)構(gòu)組成，是極其穩(wěn)定的中樞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)

6、態(tài)維持屏障。嚴(yán)重缺氧損傷BBB的原因包括內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和緊密連接蛋白降解，但相關(guān)分子機(jī)制仍未完全闡明。因此，探索BBB損傷的原因及分子機(jī)制，將有助于尋找HACE和AMS預(yù)防和治療方法。
　　綜上所述，本課題擬在前期工作的基礎(chǔ)上，從缺氧飲水減少和BBB損傷兩個(gè)方向，研究急性缺氧大鼠水代謝紊亂的發(fā)生機(jī)制，這不僅有助于提高我們對(duì)高原習(xí)服機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也為我們做好急進(jìn)高原部隊(duì)的衛(wèi)勤保障奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　1

7、.本研究采用動(dòng)物低壓艙建立大鼠缺氧模型。分別在模擬3700m、4000m、6000m缺氧條件下研究大鼠飲水減少的發(fā)生及分子機(jī)制，在模擬8000m缺氧條件下研究血腦屏障損傷及修復(fù)方法。采用低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱和三氣缺氧小室，在體外構(gòu)建細(xì)胞缺氧模型。
　　2.采用大鼠顱內(nèi)置管技術(shù)，缺氧前10min，腦室注射TRPV1抑制劑SB-705498，TRPV4抑制劑Gadolinium和HC-067047，缺氧相應(yīng)時(shí)間后精確測(cè)量動(dòng)物飲水量、顱內(nèi)溫度

8、變化、滲透壓變化。體外培養(yǎng)SFO區(qū)原代神經(jīng)元和HEK293細(xì)胞，分別通過(guò)質(zhì)粒和siRNA干預(yù)建立TRPV4過(guò)表達(dá)和敲降模型，利用Westernblot、Co-IP、IF、ELISA及Fura-3鈣成像技術(shù)檢測(cè)TRPV4蛋白表達(dá)及鈣通道開(kāi)放情況。
　　3.采用大鼠顱內(nèi)置管技術(shù)，在大鼠缺氧前7d，特異性的AVV-shRNA靶向敲降CVOs區(qū)TRPV4表達(dá)，通過(guò)中樞注射重組Adropin蛋白、TRPV4抑制劑HC-067047，CamK

9、K抑制劑STO-609，外周注射高濃度Adropin抗體等方法，缺氧相應(yīng)時(shí)間后測(cè)量動(dòng)物飲水量、IF檢測(cè)神經(jīng)元活性、Westernblot檢測(cè)TRPV4-CamKK-AMPK信號(hào)通路變化;
　　4.采用大鼠顱內(nèi)置管技術(shù)，大鼠缺氧前48h，通過(guò)siRNA靶向敲降SIRT-3，缺氧前1h腹腔注射不同濃度的Minocycline，采用膠體金-電鏡和伊文思藍(lán)示蹤法檢測(cè)血腦屏障功能;在HBMECs細(xì)胞中，利用Westernblot、qRT-P

10、CR、IF、螢光素酶報(bào)告基因法，檢測(cè)HIF-1α/SIRT-3/PHD-2信號(hào)通路和緊密連接蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.與常氧組相比，大鼠4000m缺氧6h不會(huì)引起血液滲透壓改變及顱內(nèi)溫度變化，但是飲水量下降75％;與缺氧組相比，第三腦室注射TRPV4抑制劑Gadolinium和HC-067047，能夠顯著增加飲水量，而TRPV1抑制劑SB-705498不會(huì)引起飲水量增加;此外，與野生型相比，常氧條件下TRPV4-/

11、-小鼠飲水量沒(méi)有明顯變化，但是在缺氧條件下，TRPV4-/-小鼠飲水量顯著增加。無(wú)論是過(guò)表達(dá)TRPV4的HEK293細(xì)胞，還是原代培養(yǎng)的SFO區(qū)神經(jīng)元，缺氧或TRPV4激動(dòng)劑4α-PDD都會(huì)使胞內(nèi)鈣離子迅速增加，產(chǎn)生鈣離子脈沖，但是，在普通HEK293細(xì)胞或敲降TRPV4的SFO神經(jīng)元中，缺氧幾乎不能產(chǎn)生鈣離子脈沖;在表達(dá)TRPV4的HEK293細(xì)胞和原代培養(yǎng)的SFO區(qū)神經(jīng)元中敲降血紅素氧合酶-2(heme oxygenase-2，HO

12、-2)后，缺氧產(chǎn)生鈣離子脈沖明顯減弱，但此時(shí)TRPV4激動(dòng)劑4α-PDD和抑制劑Gadolinium仍然能調(diào)控胞內(nèi)鈣離子變化;TRPV4和HO-2在SFO神經(jīng)元中以二聚體的形式存在。
　　2.與常氧組相比，大鼠3700m缺氧血清和CVOs區(qū)腦組織Adropin蛋白增加，同時(shí)CVOs區(qū)c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少;與單純?nèi)毖踅M相比，注射Adropin中和抗體后飲水量升高35％，c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加60％。常氧情況下，大鼠中樞注射重組

13、Adropin蛋白后飲水量和CVOs區(qū)c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著減少;而與對(duì)照組相比，TRPV4敲降組注射重組Adropin蛋白后飲水量和c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加。與對(duì)照組相比，中樞注射重組Adropin蛋白后CVOs區(qū)p-CamKK、p-AMPKα蛋白顯著增加，c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，大鼠飲水量下降;而注射TRPV4抑制劑HC-067047或CamKK抑制劑STO-609均能降低CVOs區(qū)p-CamKK、p-AMPKα蛋白的表達(dá)

14、，增加c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，部分恢復(fù)大鼠飲水量。
　　3.與常氧組相比，8000m缺氧伊文思藍(lán)和膠體金血腦屏障通透性顯著增高，HBMECs細(xì)胞跨細(xì)胞電阻TEER減小，HIF-1α、MMP9、MMP2和VEGF蛋白及mRNA表達(dá)顯著增加，緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白及mRNA降低，HIF-1α對(duì)VEGF轉(zhuǎn)錄活性顯著增高。與溶劑對(duì)照組相比，Minocycline劑量依賴性的降低伊文思藍(lán)和膠體金通透性，

15、增加內(nèi)皮細(xì)胞TEER，下調(diào)MMP9、MMP2和VEGF蛋白及mRNA表達(dá)，但Minocycline僅能上調(diào)HIF-1α蛋白而非rnRNA表達(dá)，Minocycline能同時(shí)上調(diào)ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白及mRNA表達(dá)。然而，HIF-1α抑制劑YC-1或穩(wěn)定劑DMOG均能調(diào)控Minocycline引起的上述變化。與常氧組相比，缺氧誘導(dǎo)HIF-1α上調(diào)的同時(shí)顯著下調(diào)SIRT-3和PHD-2蛋白表達(dá)，與缺氧組相比，Min

16、ocycline抑制HIF-1α同時(shí)上調(diào)SIRT-3和PHD-2蛋白表達(dá)，SIRT-3敲降后Minocycline對(duì)HIF-1α的抑制作用減弱，SIRT-3和PHD-2顯著上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.急性缺氧可引起大鼠飲水量減少，嚴(yán)重的急性缺氧可損傷大鼠血腦屏障。
　　2.急性缺氧大鼠飲水減少與中腦SFO區(qū)神經(jīng)元TRPV4開(kāi)放密切相關(guān)。TRPV4與HO-2在SFO區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞膜上以復(fù)合體的形式存在。缺氧時(shí)，大鼠飲水減少

17、有可能是通過(guò)HO-2感知氧分壓變化、開(kāi)放效應(yīng)分子TRPV4引起中樞SFO區(qū)神經(jīng)元胞漿[Ca2+]i升高，進(jìn)而抑制口渴中樞所致。
　　3.急性缺氧引起小分子蛋白Adropin表達(dá)增高參與大鼠飲水減少的機(jī)制。Adropin通過(guò)作用于中樞CVOs區(qū)TRPV4鈣離子通道，引起其下游鈣離子相關(guān)的Camkk-AMPK信號(hào)通路磷酸化，活化TRPV4渴覺(jué)抑制性神經(jīng)元，減少大鼠飲水量。
　　4.嚴(yán)重缺氧損傷血腦屏障，Minocycline通過(guò)