西紅花酸對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景： 心血管病變是糖尿病患者的主要死亡原因，其大血管病變(主要是動脈粥樣硬化)和微血管病變是糖尿病病人致病率和死亡率最主要的原因之一。糖尿病導(dǎo)致心血管病的機(jī)制是復(fù)雜的、多方面的，其中血管內(nèi)皮功能異常是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生的重要因素。高血糖可通過糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)途徑、多元醇途徑、蛋白激酶C激活途徑、己糖胺途徑和氧化應(yīng)激等多種機(jī)制導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能不全，其損傷的機(jī)理并不十分清楚，其中高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是研究重點(diǎn)和

2、熱點(diǎn)之一。 細(xì)胞凋亡(apoptosis)，亦稱為程序化的細(xì)胞死亡(Programmed cell death，PCD)，是一種不同于細(xì)胞壞死的生理性或者病理性的死亡過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等多個方面。目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡在器官發(fā)育、傷口愈合、免疫反應(yīng)等過程中調(diào)控細(xì)胞增殖與更新間的平衡，維持組織器官正常生理功能及細(xì)胞數(shù)量的相對穩(wěn)定。高胰島素血癥、AGE4、血管緊張-II、氧化的LDL、活性氧(reactive o

3、xygen species，ROS)以及炎性細(xì)胞因子等多種因素均可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究證實(shí)，高糖誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，而活性氧進(jìn)一步能引起細(xì)胞功能失調(diào)，甚至細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡在高糖對內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中扮演重要的角色。因此，防治高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡在預(yù)防糖尿病血管并發(fā)癥方面具有重要的作用。 研究證明，Akt的激活能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活。Akt，又稱PKB，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要通過PI-3K激活。Akt的Ser

4、-473和Thr-308位點(diǎn)被磷酸化后，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)。PI-3K在多種死亡信號誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程中起著重要的預(yù)防作用。Akt能引起抗凋亡基因家族bcl-2的表達(dá)，激活內(nèi)皮源性的一氧化氮合酶，從而產(chǎn)生NO防止超氧陰離子產(chǎn)生歧化產(chǎn)物。因此，PI-3K/Akt/NO信號通路在防止ROS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要的作用。因此，該信號通路是本研究的焦點(diǎn)之一。 NF-κB是多種信號通路的交匯點(diǎn)，NF-κB的激活能控制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長

5、、存活和凋亡過程中的多個基因的轉(zhuǎn)錄。最近的研究證明，NF-κB的激活能下調(diào)促凋亡的JNK信號途徑，進(jìn)而預(yù)防多種細(xì)胞類型的凋亡。但是，對于內(nèi)皮細(xì)胞而言，NF-κB的激活能促進(jìn)凋亡，ROS依賴的NF-κB的激活在高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用。因此，NF-κB途徑也是研究的重點(diǎn)之一。 西紅花酸是西紅花提取物的有效成分之一，有多不飽和共軛烯酸結(jié)構(gòu)，屬于類胡蘿卜素類。研究表明西紅花酸具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、降血脂、心肌保護(hù)

6、、肝臟保護(hù)以及精神神經(jīng)疾病的保護(hù)治療作用。西紅花酸對糖尿病亦具有有益的保護(hù)作用。但是，西紅花酸是否能抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，國內(nèi)外未見報道。因此，本文通過內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)，建立高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型，從生化指標(biāo)、形態(tài)學(xué)、蛋白表達(dá)等多方面比較系統(tǒng)地觀察了西紅花酸對高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用并探討其可能的機(jī)制，為西紅花酸在臨床用于防治糖尿病及其血管并發(fā)癥提供理論依據(jù)。 第一部分高糖體外誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及西紅花酸對其抑制作

7、用的觀察 目的：觀察高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的促凋亡作用及西紅花酸對其抑制作用。 方法： 取健康、足月新生兒產(chǎn)后的新鮮臍帶，原代培養(yǎng)、傳代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞并根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)、生長習(xí)性以及Ⅷ因子抗原等鑒定。選生長良好的HUVECs第3-5代用于試驗(yàn)。試驗(yàn)分為：①對照組(NG)：含有終濃度5.5mM的葡萄糖，與內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)24，36，48h。②高糖15組(HGl5)：含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液和含終濃度

8、為15mmol/L的葡萄糖，與內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)24，36，48 h。②高糖組33(HG33)：含有終濃度為33mM的葡萄糖，與內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)24，36，48h。③高糖組+西紅花酸組：不同終濃度的西紅花酸(0.01，0.1，1.0μM；分別為HG+C1，HG+C2，HG+C3組)：與內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)先培養(yǎng)18h，然后加入終濃度為33mM的葡萄糖刺激，繼續(xù)共同培養(yǎng)24，36，48h。在不同的時間點(diǎn)收集細(xì)胞，觀察西紅花酸對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的

9、影響，分別采用相差顯微鏡和熒光顯微鏡結(jié)合Hoechst 33258細(xì)胞DNA染色，觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)改變；雙抗體夾心酶免疫法特異性檢測細(xì)胞溶解物中的核小體片段；應(yīng)用ELISA法檢測凋亡效應(yīng)子caspase-3的活性。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定及細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)鑒定方法：在倒置相差顯微鏡下觀察顯示，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)時，呈單層鋪路石樣。通過Ⅷ因子抗體免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，原代和傳代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)見陽性的棕色顆粒。凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞Hoechs

10、t染色后，細(xì)胞核呈明顯形態(tài)變化，可見染色質(zhì)濃染，或呈碎塊狀致密濃染等特征性變化；在熒光顯微鏡下，凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞中染色質(zhì)濃縮，核染色較明亮，成新月形或分葉狀的藍(lán)色核，細(xì)胞核可裂解為大小不一的碎片，可見凋亡小體。而正常細(xì)胞的胞核形態(tài)大小較為一致，正常細(xì)胞核發(fā)出均勻藍(lán)色熒光，染色較弱。 結(jié)果： 成功培養(yǎng)原代內(nèi)皮細(xì)胞并傳代，按照上述分組給予干預(yù)。結(jié)果顯示，在高糖條件下，培養(yǎng)24h內(nèi)，凋亡并不明顯。36h后凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目明顯增

11、多。細(xì)胞凋亡試劑盒的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在36h和48h顯著增加(與0h和24h相比，p＜0.01)。而且，在孵育48h的凋亡比36h時明顯增加(p＜0.01)。caspase-3的檢測顯示，高糖作用于HUVECs36和48h后，caspase-3活性明顯增加(與0h和24h相比，P＜0.01)，而且，48h時的活性顯著高于36h(p＜0.01)，同時，凋亡隨著高糖濃度的增加而增加。 西紅花酸對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞

12、凋亡的影響：相差顯微鏡和熒光顯微鏡都發(fā)現(xiàn)，HUVECs與西紅花酸預(yù)先孵育18h，再與高糖共同培養(yǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡數(shù)目明顯減少。細(xì)胞凋亡試劑盒ELISA分析表明，高糖時間依賴性地誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而預(yù)先與西紅花酸孵(0.1，1.0μM)育后內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡明顯減輕。高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3的活性增加亦可被西紅花酸(0.1，1.1μM)所顯著抑制。但是在西紅花酸的低濃度(0.01μM)抑制作用不明顯。 結(jié)論：1.高糖在與內(nèi)

13、皮細(xì)胞共同孵育36h后能誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，而且，凋亡隨著高糖濃度的增加而增加。 2.西紅花酸劑量依賴性的抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。 第二部分西紅花酸抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究 目的：本研究旨在探討紅花酸抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 方法： 以西紅花酸(1.0μM)與HUVECs預(yù)先孵育18h，然后以高糖(33mM)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡48h，以終濃度為5.5mM的葡萄

14、糖為正常對照。分別檢測培養(yǎng)上清液中MDA、SOD的活性并以DCFH-DA為探針檢測細(xì)胞的ROS，以觀察西紅花酸的抗氧化作用；應(yīng)用PI-3K抑制劑LY294002(10μM)、NOS抑制劑L-NAME(100 μM)或NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨甲基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC，10μM)與內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)先孵育，然后收集細(xì)胞，以分別研究西紅花酸對PI-3K/Akt/eNOS和NF-κB/JNK/C

15、aspase-3途徑的影響。以Western blot方法檢測p-Akt、Akt、p-eNOS、以及IκB、p-JNK蛋白含量變化，以EMSA法測定NF-κB的活性，觀察西紅花酸和高糖對PI-3K/Akt/eNOS通路、NF-κ B途徑的影響，而且觀察外源性NO(sodium nitroprusside，SNP，10μM)和內(nèi)源性NO對NF-κB的活性，探討西紅花酸拮抗高糖誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。 結(jié)果： 本研究發(fā)現(xiàn)

16、西紅花酸能抑制高糖誘導(dǎo)HUVECs的凋亡，該作用可被PI-3K抑制劑LY294002、NOS抑制劑L-NAME所減弱。西紅花酸能增加Akt和eNOS的磷酸化，增加NO產(chǎn)量；NF-kB的抑制劑PDTC能明顯抑制p-JNK的蛋白表達(dá)和Caspase-3的活性，而西紅花酸能增加IκB的蛋白表達(dá)，抑制高糖誘導(dǎo)的NF-κB活性的升高，以及降低p-JNK的表達(dá)，抑制Caspase-3的活性；外源性和內(nèi)源性NO均可抑制NF-κB的活性。 結(jié)論

17、 1.高糖能通過對NF-kB/JNK/Caspase-3途徑的活化和對Akt/e-NOS/NO的抑制誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 2.西紅花酸具有很強(qiáng)的抗氧化活性。 3.西紅花酸一方面通過抑制高糖激活的NF-k B/JNK/Caspase-3途徑，另一方面，增加Akt和eNOS的磷酸化，通過Akt/eNOS/NO途徑，抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。而且，西紅花酸通過PI-3K/Akt/eNOS途徑對NF-kB的活性有反饋抑

18、制。 4.西紅花酸有助于防治糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生，這為西紅花酸在臨床中的應(yīng)用提供了重要的理論根據(jù)。 研究創(chuàng)新點(diǎn)和意義：本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型中，氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致HUVECs的凋亡。西紅花酸可通過抗氧化作用，增加IkB的蛋白表達(dá)，抑制NF-kB活性，繼而抑制JNK/Caspase-3活性；也可增強(qiáng)AKT和eNOS的活化，繼之NO活性增加，從而發(fā)揮抗凋亡作用。本研究為防治糖尿病血管并發(fā)癥的新藥研發(fā)提供