AMPK調控鈣內流對高糖誘導的內皮細胞凋亡的影響及其機制研究.pdf

1、隨著我國社會人口老齡化的加劇，老年人的健康問題越來越受到關注。老年患者作為糖尿病的主體人群，糖尿病的心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生是臨床上致死和致殘的重要原因，而動脈粥樣硬化是糖尿病最常見的心腦血管并發(fā)癥。但其病因尚未完全闡明。內皮細胞的過度凋亡是內皮細胞功能障礙的重要表現(xiàn)形式，同時也是動脈粥樣硬化形成的始動因素。
　　有研究表明長期高糖刺激，血管內皮細胞的主要特征是在轉錄因子調節(jié)下，產(chǎn)生一系列相關因子，導致內皮細胞功能障礙，引起糖尿病血管

2、并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。高糖在內皮細胞凋亡中起著重要作用，高糖誘導氧化應激，通過一系列復雜信號通路直接或間接引起血管內皮細胞凋亡。高糖引起內皮凋亡的機制很多，如氧化應激、內質網(wǎng)應激、鈣離子內流。其中Ca2+濃度升高是其重要機制。鈣庫依賴性鈣通道(SOCC)在細胞凋亡增殖起著重要作用。但高糖對其具體調節(jié)機制尚需進一步研究。
　　AMPK是由α、β、γ三個亞基組成的異源三聚體，α亞基行使催化功能、β和γ亞基行使調節(jié)功能。α亞基有α1和α2

3、兩個亞型，在內皮細胞中AMPKα1和α2均有表達，但以表達以α1亞單位為主。最近的證據(jù)表明AMPK在延緩動脈粥樣硬化的形成和保護血管功能等過程中充當重要的角色，但其具體機制尚需進一步研究。
　　目的：
　　本研究以離體培養(yǎng)胰腺血管內皮細胞(MS1)和構建糖尿病動脈粥樣硬化小鼠模型為研究對象，采用激光共聚焦檢測鈣內流、TUNEL檢測內皮細胞凋亡等方法，力圖證實:1）、AMPK抑制高糖誘導的內皮細胞凋亡;2）、高糖誘導的內皮細胞

4、凋亡與鈣離子內流相關;3）、AMPK抑制高糖誘導的ROS生成;4）、AMPK抑制高糖介導的SOCC蛋白表達以及鈣離子內流;5）、AMPK抑制動脈粥樣斑塊形成。
　　方法:
　　1、采用離體培養(yǎng)MS1內皮細胞株，應用TUNEL法檢測內皮細胞凋亡。細胞分6組為:高糖組(30mM高糖刺激48h)、AMPK激動劑組(1mMAICAR預處理2h)、高糖+ AICAR組(30mM高糖處理48h+1mMAICAR預處理2h)、SOC通道抑

5、制劑組(100uM2-APB預處理2h)和高糖+SOC通道抑制劑組(30mM高糖處理48h+100uM2-APB預處理2h)，另外設立對照組（未用任何處理因素）。
　　2、采用激光共聚焦檢測鈣離子內流情況，將共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的內皮細胞置于Hank液中，應用特異性的熒光染料Fluo-3AM檢測內鈣離子濃度。細胞分組為對照組、高糖組、AICAR組、高糖+AICAR組、SOC通道抑制劑(2-APB)和高糖+SOC通道抑制劑組。

6、　　3、采用DHE探針觀察細胞內ROS形成，將內皮細胞接種于六孔板中，細胞孵育DHE探針后于熒光顯微鏡下觀察ROS生成。細胞分組為對照組、高糖組、AICAR組、高糖+AICAR組。
　　4、采用Western Blotting技術檢測SOCC蛋白。內皮細胞以105密度接種于六孔板中，每組三個副孔，細胞分組為對照組、高糖組、AICAR組、高糖+AICAR組，以1mMAICAR預處理2h，再給予高糖刺激48h。用PBS清洗細胞兩次后，

7、收集各組細胞，應用WB技術檢測AMPK對SOC相關Stim1、Orai1蛋白表達的影響。
　　5、采用油紅O、HE染色觀察主動脈斑塊形成。實驗分組為普通飼料組、高脂組、STZ組、STZ組+對照病毒組、STZ組+AMPKα1過表達組，取小鼠胸主動脈，縱向切開后，采用油紅O染色觀察主動脈血管內斑塊形成，其余血管制成石蠟切片后，利用HE染色觀察AMPK對動脈粥樣硬化形成的影響。
　　結果：
　　1.高糖處理血管內皮細胞后凋亡

8、明顯增多(P＜0.05)，而與高糖刺激組相比，預處理AMPK激動劑能顯著抑制高糖刺激的內皮細胞凋亡(P＜0.05)
　　2.高糖刺激內皮細胞后鈣離子內流明顯增加，而給予2-APB預處理后，高糖介導的內皮細胞凋亡和鈣內流明顯能被SOC通道抑制劑抑制(P＜0.05)
　　3.高糖刺激內皮細胞后，細胞內ROS生成增多，而給予AICAR預處理后，高糖誘導的ROS生成明顯能被AMPK激動劑AICAR抑制(P＜0.05)
　　4.

9、高糖刺激內皮細胞后，Stim1、Orai1蛋白表達增加，而與高糖組相比，高糖+AICAR組能夠明顯抑制Stim1、Orai1表達和鈣內流(P＜0.05)
　　5.與高脂飼料組相比，小鼠給予STZ誘導糖尿病后，主動脈粥樣斑塊形成明顯，而給予AMPKα1過表達慢病毒注射后，主動脈斑塊形成明顯減少(P＜0.05)
　　結論：
　　1.高糖誘導內皮細胞凋亡，而AMPK能顯著抑制高糖誘導的內皮凋亡。
　　2.高糖誘導的內皮