VEGF在高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)病的關(guān)鍵部位在于血管內(nèi)皮細(xì)胞及其下層的血管平滑肌細(xì)胞，而既作為物理性屏障結(jié)構(gòu)又是內(nèi)分泌活躍的組織機(jī)構(gòu)--內(nèi)皮細(xì)胞，在糖尿病高血糖的病理狀態(tài)下極易受到損傷而發(fā)生一系列的連鎖病理反應(yīng)，這是造成血管并發(fā)癥的重要環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高濃度葡萄糖在作用早期以劑量依賴性和時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)大血管和微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死。長期的高血糖癥是視網(wǎng)膜微血管糖尿病相關(guān)性損傷和糖尿病性視網(wǎng)膜病發(fā)展中的中心促發(fā)因素，視

2、網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞直接暴露于血漿中，內(nèi)皮細(xì)胞被高血糖損傷以及隨之發(fā)生的血-視網(wǎng)膜屏障被打破可能是目前已知糖尿病性視網(wǎng)膜病的早期原因。當(dāng)前已明確內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙可能促進(jìn)異常血管生長，但在糖尿病中高血糖引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的分子調(diào)節(jié)機(jī)制不甚明確，高血糖是否通過破壞血管增生因子表達(dá)，特別是通過改變血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達(dá)，從而引起血管內(nèi)皮功能的障礙尚不清楚。以血管增生相關(guān)因子為靶點(diǎn)正成為治療糖尿病血管并發(fā)癥等血管增生性疾病的研究熱點(diǎn)

3、，作為血管生長因子中的代表性因子VEGF，探討其在高糖病理狀態(tài)下的表達(dá)及其作用機(jī)制，對(duì)于全面認(rèn)識(shí)糖尿病血管并發(fā)癥具有重要意義。 研究目的: 本研究主要探討高糖病理狀態(tài)下血管因子VEGF表達(dá)失調(diào)及在高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中作用分子機(jī)制： 1.證實(shí)高糖具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用；闡明高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，即通過激活線粒體凋亡通路、活性氧損傷和鈣超載等分子機(jī)制誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 2.驗(yàn)證高糖作用于血管內(nèi)

4、皮細(xì)胞時(shí)，血管增生刺激因子VEGF下調(diào)規(guī)律；明確VEGF下調(diào)在高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，上調(diào)VEGF可抑制高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 3.探討VEGF下調(diào)的分子機(jī)制，闡明高糖下調(diào)VEGF的分子機(jī)制與ERK1/2MAPK密切相關(guān)，提出高糖下調(diào)VEGF可能通過抑制ERKMAPK存活信號(hào)通路起作用。 主要研究內(nèi)容和結(jié)果: 第1章高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型的建立及驗(yàn)證。 1.1高糖誘導(dǎo)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞HRCE

5、C及大血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC凋亡。TUNEL(原位末端標(biāo)記)對(duì)高糖處理的HRCEC內(nèi)皮細(xì)胞染色結(jié)果顯示，TUNEL陽性信號(hào)為呈現(xiàn)棕黃色或黃色熒光，位于胞核，呈圓形、環(huán)行或顆粒狀，證實(shí)高糖可誘導(dǎo)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Hoechst染色后在藍(lán)色熒光下顯示，Hoechst陽性信號(hào)為胞核呈現(xiàn)明亮染色區(qū)，流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI雙染法定量檢測(cè)高糖作用于HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞后凋亡率為(14.1±3.3)％，顯著高于正常組(3.3±0.44)％

6、的凋亡率。表明高濃度葡萄糖能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。 第2章高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中VEGF的表達(dá)改變及調(diào)控。 2.1高糖下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)。RT-PCR半定量分析顯示，內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)高糖處理后的早期階段，VEGFmRNA表達(dá)量隨糖濃度升高而下降，糖濃度從15mM升高到25mM，VEGFmRNA分別是正常時(shí)的65％和40％；Westernblotting半定量分析表明，VEGF蛋白分別是正常時(shí)的8

7、3％和45％。與正常糖濃度(5mM)處理相比，無論是mRNA水甲還是蛋白水甲，二者均具有顯著性變化。按時(shí)間點(diǎn)變化，VEGF蛋白在6h開始表達(dá)下降。 2.2VEGF拮抗高糖對(duì)p42/44MAPK活性的下調(diào)作用。Westernblotting分析P42/44MAPK活性顯示，p42/44MAPK活性隨時(shí)間有所改變，高糖作用后p42/44MAPK活性短時(shí)間(15min)內(nèi)顯著下降，隨著時(shí)間延長，活性逐漸恢復(fù)。外源性VEGF蛋白加入高糖

8、處理組中，可以拮抗高糖對(duì)P42/44MAPK活性的下調(diào)作用，表明VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖信號(hào)分子有促進(jìn)作用，可以拮抗高糖早期對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。 2.3抑制p42/44MAPK活性可以下調(diào)VEGF。采用p42/44MAPK特異性抑制劑PD98059阻斷p42/44MAPK活性后，觀察VEGF表達(dá)改變，發(fā)現(xiàn)阻斷p42/44MAPK活性后，VEGF的表達(dá)也明顯受到抑制。 第3章高糖下調(diào)VEGF的分子機(jī)制。 3.1VE

9、GF拮抗高糖上調(diào)Bax/Bcl-2比值、激活Caspase3切割的作用。Westernblotting結(jié)果顯示，高糖呈時(shí)間依賴性上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，在24h表達(dá)具有顯著性差別。而外源性VEGF可以拮抗高糖誘導(dǎo)的Bax/Bcl-2比值上調(diào)效應(yīng)。同樣采用Westernblotting分析，結(jié)果也表明，高糖作用于內(nèi)皮細(xì)胞一段時(shí)間后(12h以上)，可以激活凋亡蛋白酶Caspase3的切割活性，并且隨著作用時(shí)間延長，切割產(chǎn)物更為明顯。而外源

10、性VEGF可以抑制Caspase3的切割活性，使切割產(chǎn)物減少。說明VEGF對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有保護(hù)性分子水平反應(yīng)。 3.2VEGF拮抗高糖誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生和鈣離子內(nèi)流。通過Fenton反應(yīng)顯示，高糖可以促進(jìn)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加，而外源性VEGF可以抑制ROS產(chǎn)生過多。Fluo-3熒光染料分析顯示，贏糖作用內(nèi)皮細(xì)胞后，胞內(nèi)鈣離子濃度[Ca2+]i升高，說明高糖可以促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，而VEGF可以抑制這一過程發(fā)生。