MicroRNA-21在高糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡中作用的研究.pdf

1、論文Ⅰ MicroRNA-21在高糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡中作用的研究
　　背景:
　　微小RNA(MicroRNA，miRNA)最先是由Ruvkun G在線蟲中發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育時(shí)序功能的小分子RNA。多項(xiàng)研究已證明，miRNAs參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤形成等多種生物學(xué)過程的基因表達(dá)與調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)microRNA-21（miR-21）在多種心血管疾病中的表達(dá)均增加，并參與了細(xì)胞增殖和分化等過程。研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣斑

2、塊中miR-21的表達(dá)上調(diào)，但miR-21參與粥樣硬化的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。巨噬細(xì)胞在易損斑塊形成、發(fā)展及破裂中的作用已被廣泛研究，巨噬細(xì)胞凋亡的機(jī)制目前尚在研究中，目前的研究發(fā)現(xiàn)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了巨噬細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)miR-21可通過下調(diào)PDCD4的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖。另外，miR-21的過表達(dá)可以抑制正常細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，抑制miR-21可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　目的:
　　研究miR-21在高濃度葡萄糖作用下巨噬細(xì)

3、胞中的表達(dá)情況，并探討miR-21在高濃度葡萄糖刺激下抑制巨噬細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)及處理:應(yīng)用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)Raw264.7細(xì)胞50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞生長(zhǎng)至近匯合狀態(tài)時(shí)用細(xì)胞刮刀刮除細(xì)胞，重新種植于6孔或12孔板中。Raw264.7細(xì)胞生長(zhǎng)至融合的70％-80％時(shí)，換1％血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)孵育過夜，使細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)靜止期，隨后進(jìn)行干

4、預(yù)。應(yīng)用不同濃度的葡萄糖(5.5mmol/L、25mmol/L)及甘露醇(25mmol/L)分別處理Raw264.7細(xì)胞24小時(shí)。
　　2.實(shí)時(shí)定量PCR方法:應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)方法檢測(cè)Raw264.7細(xì)胞miR-21及 PDCD4、Caspase-3、PTEN(phosphatase and tensin homolog deletedon chromosome ten，磷酸酶基因)mRNA的表達(dá)情況。
　

5、　結(jié)果:
　　1.為研究高濃度葡萄糖對(duì)巨噬細(xì)胞中miR-21表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，Raw264.7細(xì)胞在無血清的狀態(tài)下，用25mmol/L葡萄糖和25mmol/L甘露醇分別刺激細(xì)胞0h、1h、3h、6h、12h、24h后收集細(xì)胞，檢測(cè)miR-21的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HG可有效刺激Raw264.7細(xì)胞miR-21表達(dá)上調(diào)，而甘露醇高滲刺激巨噬細(xì)胞miR-21表達(dá)降低。HG刺激巨噬細(xì)胞miR-21表達(dá)增加上調(diào)還隨刺激時(shí)間的增加而逐漸增加，提

6、示HG刺激巨噬細(xì)胞miR-21表達(dá)的上調(diào)呈時(shí)間依賴性。與甘露醇高滲組相比，H6處理細(xì)胞1h后miR-21表達(dá)開始明顯增加(P＜0.01)，6h時(shí)miR-21表達(dá)達(dá)到高峰(P＜0.01)，12h后表達(dá)開始降低。
　　2.為了研究HG對(duì)Raw264.7細(xì)胞中PDCD4 mRNA表達(dá)的影響，Raw264.7細(xì)胞用葡萄糖和甘露醇分別處理細(xì)胞0h、6h、12h、24h、48h、72h后，檢測(cè)PDCD4 mRNA的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在12h時(shí)

7、HG刺激使Raw264.7細(xì)胞PDCD4 mRNA表達(dá)量明顯下降(P＜0.05)，24h之后其mRNA表達(dá)量開始增加(P＜0.01)，而甘露醇在6h時(shí)可引起PDCD mRNA顯著增加(P＜0.01)，之后對(duì)PDCD4的作用不明顯。這表明HG對(duì)巨噬細(xì)胞PDCD4 mRNA表達(dá)的影響也刺激時(shí)間有關(guān)，12h之前降低其表達(dá)，之后表達(dá)增加。Western Blot進(jìn)一步證實(shí)，HG處理巨噬細(xì)胞12h后，PDCD4蛋白表達(dá)量亦顯著增加。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)

8、，HG可引起巨噬細(xì)胞PTEN mRNA和蛋白表達(dá)在12h內(nèi)PTEN表達(dá)量明顯下降(P＜0.05)。
　　3.為了研究高濃度葡萄糖對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響，Raw264.7細(xì)胞分別用HG和甘露醇孵育不用時(shí)間后(0h、24h、48h)，用裂解細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，westernblot檢測(cè)活化caspase-3的蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，與甘露醇組相比，HG能明顯增加活化caspase-3蛋白表達(dá)量。HG處理Raw264.7細(xì)胞24h后，活化c

9、aspase-3蛋白表達(dá)量開始明顯增加，48h時(shí)表達(dá)量增加更明顯。HG處理Raw264.7細(xì)胞0h、24h、48h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，HG組巨噬細(xì)胞的凋亡明顯增加，且呈時(shí)間依賴性。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著HG刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，壞死的細(xì)胞也逐漸增多。
　　結(jié)論:
　　1.miR-21在高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的Raw264.7巨噬細(xì)胞中表達(dá)增加，這種表達(dá)上調(diào)呈時(shí)間依賴性。
　　2.miR-21

10、通過調(diào)節(jié)其靶基因PDCD4對(duì)高濃度葡萄糖誘發(fā)的巨噬細(xì)胞凋亡起保護(hù)效應(yīng)。
　　論文Ⅱ 匹伐他汀鈣對(duì)高膽固醇血癥患者左心房功能的影響
　　背景:
　　心血管疾病是我國(guó)目前人群死亡的首位死亡原因，近年來我國(guó)冠心病的發(fā)生率及死亡率逐漸上升。研究表明，血清總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇水平的升高是冠心病和缺血性腦卒中發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，因此，對(duì)高膽固醇血癥患者的防治必須給予高度重視。
　　3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還

11、原酶抑制劑(HMG-CoA)，俗稱“他汀類”，可通過抑制肝細(xì)胞內(nèi)的膽固醇合成限速酶，降低膽固醇的合成，并通過增加低密度脂蛋白受體的表達(dá)來降低循環(huán)中低密度脂蛋白的水平。研究表明，患者從他汀類藥物的臨床獲益絕大部分是通過其降脂作用，同時(shí)這些藥物可在心血管疾病的多方面發(fā)揮其非降脂作用，包括改善內(nèi)膜功能、增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性、降低氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，抑制血管壁的血栓形成、抑制心肌纖維化等。
　　研究表明高膽固醇血癥患者心房纖顫的發(fā)

12、生率增高。左心房有儲(chǔ)存器功能、管道功能及助力泵功能這三個(gè)功能，通過這三個(gè)功能，左心房可在生理及各種病理狀態(tài)下發(fā)揮其作用。應(yīng)用應(yīng)變/應(yīng)變率技術(shù)可評(píng)價(jià)高血壓、代謝綜合征、肥胖患者等的左心房功能，且應(yīng)用此技術(shù)測(cè)定的心肌功能可以準(zhǔn)確反映心肌本身的收縮舒張?zhí)匦?，同時(shí)并不受周圍組織牽拉影響。本研究擬采用應(yīng)變/應(yīng)變率技術(shù)評(píng)價(jià)高膽固醇血癥患者左心房功能的變化，并研究應(yīng)用匹伐他汀鈣后，高膽固醇血癥患者左心房功能的變化。
　　目的:
　　應(yīng)用應(yīng)

13、變/應(yīng)變率技術(shù)評(píng)價(jià)高膽固醇血癥患者左心房功能的變化，評(píng)價(jià)匹伐他汀鈣對(duì)高膽固醇血癥患者左心房功能的影響。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為雙盲隨機(jī)研究，選取高膽固醇血癥病人40例，根據(jù)匹伐他汀鈣的用藥量隨機(jī)分為1mg劑量組和2mg劑量組，各20例。高膽固醇血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)為:空腹血清總膽固醇(TC)水平為5.72mmol/L≤TC≤12.7mmol/L和/或空腹低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平為3.64mmol/L≤TC≤6.5

14、mmol/L。選取與之年齡、性別相匹配的正常對(duì)照30例。
　　結(jié)果:
　　1.對(duì)照組與高膽固醇血癥組治療前、后臨床基本指標(biāo)比較
　　五組患者性別、年齡、身高、心率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;高膽固醇血癥組2mg劑量組治療前、后體重及腰圍較對(duì)照組增高，高膽固醇血癥組體重指數(shù)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;高膽固醇血癥組收縮壓、舒張壓、脈壓及平均動(dòng)脈壓較對(duì)照組增高;高膽固醇血癥1mg劑量組及2mg劑量組治療后ALT較對(duì)照組增高，2mg劑量組治

15、療前后rGGT較對(duì)照組增高，2mg劑量組治療前AKP與AST較對(duì)照組略增高(P＜0.05)，高膽固醇血癥組1mg、2mg劑量組治療前后TP、ALB較對(duì)照組均增高;高脂血癥組治療前TC、TG、LDL-C均較對(duì)照組明顯增高，應(yīng)用匹伐他汀治療8周后，TC、TG、LDL-C均較治療前明顯降低，并與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HDL-C水平治療前后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;高膽固醇血癥1mg劑量組治療前肌酐水平略高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　2.正常組與高

16、膽固醇血癥組治療前基本超聲心動(dòng)圖資料的比較
　　比較發(fā)現(xiàn):高膽固醇血癥1mg劑量組治療前、后LA左右徑較對(duì)照組增大，2mg劑量組LV內(nèi)徑大于對(duì)照組(P＜0.05);2mg劑量組治療前、后A峰與對(duì)照組比較增高(P＜0.05);2mg劑量組治療前、后E/Em與對(duì)照組比較增高。 LA前后徑、AO、RV、LVEF、E峰、E峰/A峰、Em、Am、Em/Am比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.對(duì)照組與高膽固醇血癥組治療前后心房功能指標(biāo)的比較

17、r>　　高膽固醇血癥1mg劑量組及2mg劑量組治療前S、SSR及ESR均低于對(duì)照組(P＜0.05)，ASR無明顯差異;應(yīng)用匹伐他汀鈣不同劑量治療8周后，ESR均較治療前有明顯改善(P＜0.05)。1mg劑量組及2mg劑量組治療后ASR較對(duì)照組降低(P＜0.05)。進(jìn)一步比較匹伐他汀鈣1mg劑量組及2mg劑量組，發(fā)現(xiàn)兩種不同劑量匹伐他汀鈣組心房功能改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1.高膽固醇血癥患者心房功能較正常者心房存儲(chǔ)