血管外膜成纖維細胞microRNA-21在血管重構中的作用及其機制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 血管重構是多種心血管疾病(如冠心病、血管移植后狹窄、動脈粥樣硬化和高血壓等)的最終病理結局。既往研究者對于血管重構的研究重點主要放在是血管的內皮細胞和中膜的平滑肌細胞(VSMC)上，然而外膜細胞在血管重構過程中的作用沒有受到重視。近年來，大量研究表明血管外膜在調控血管生理和病理方面同樣發(fā)揮著重要作用。研究顯示，在損傷和細胞因子等病理刺激下，作為血管外膜最主要的細胞成分，外膜成纖維細胞(adventital fi

2、broblast，AF)可通過激活、表型分化和腔內遷移參與并促進血管重構。被激活的AF，增殖活性增強，并發(fā)生表型變化而分化為肌成纖維細胞(myofibroblast，MF)，發(fā)生表型變化的特征是獲得α-SMA(α-平滑肌肌動蛋白)的表達。相對于AF，MF具有更強的增殖活性和分泌細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的能力。MF的出現是組織器官對損傷進行修復過程中的一個特征。血管外膜細胞的增殖和凋亡之間的平衡對于維

3、持血管正常生理功能起著至關重要的作用。當AF和MF的正常的細胞周期出現紊亂時，就會導致凋亡減少和過多的ECM沉積，最終導致病理性血管重構。在這一病理過程中，會伴隨著一部分MF向血管腔內遷移參與并促進血管新生內膜形成。血管新生內膜形成是病理性血管重構的一個重要病理特征。因此，血管外膜細胞(包括AF和MF)增殖和凋亡之間的平衡失控而導致的細胞過度增殖和凋亡抑制是血管重構過程中的重要細胞事件。血管的AF和MF已成為抗血管重構治療的兩個重要靶細

4、胞。
　　 microRNA(miRNA)代表了一種新的基因表達調控機制。研究表明，miRNA參與了諸多重要的細胞生命活動過程，包括細胞的增殖、凋亡和分化等。而異常的細胞增殖和凋亡在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的扮演著重要角色。正因為如此，目前關于miRNA的眾多研究集中在腫瘤方面。
　　 在近些年來已發(fā)現的諸多miRNA分子中，microRNA-21(miR-21)受到研究者更多的關注。研究發(fā)現，miR21在許多腫瘤細胞中過表

5、達，并且是多種腫瘤組織中表達升高最明顯的miRNA分子之一，被稱作為“oncomir”，意思是具有致癌特性的miRNA分子，具有促增殖和抗凋亡作用。許多研究者認為，對miR-21或其靶基因的表達進行干預或許會成為將來抗癌治療的有效措施。
　　 相對于腫瘤，miRNA在心血管方面的研究起步較晚。近年來，miR-21在心血管領域的功能也逐漸受到關注。研究發(fā)現，僅次于腫瘤，在心血管疾病中miR-21的表達也明顯失調。在許多心血管疾病，

6、如血管球囊損傷、心臟肥厚和缺血性心臟病等，miR-21的表達異常。有研究顯示，大鼠頸動脈球囊損傷的血管壁中miR-21表達明顯升高；miR-21在VSMC中表達，并且能調控細胞的增殖和凋亡。有報道稱，miR-21在血管內皮中也有表達，miR-21可以通過調控內皮細胞的凋亡而影響其生理功能。但是目前國內外關于miRNA在血管外膜領域的研究報道很少，miR-21在血管AF和MF中是否表達以及是否對增殖和凋亡發(fā)揮調控功能尚不清楚。
　　

7、 研究顯示，血管增殖性疾病(如冠心病、動脈粥樣硬化等)和腫瘤在多種細胞事件和分子通路方面有著許多相似的特征。增殖和凋亡同是血管重構過程和腫瘤的兩個重要的細胞生命活動，既然miRNA在腫瘤中發(fā)揮著重要作用，因此我們完全有理由相信，miRNA在血管重構的發(fā)生和發(fā)展過程中同樣會發(fā)揮重要作用。
　　 近些年一些研究表明，以血管外膜細胞為靶點進行干預可以改善血管重構。有研究顯示，17β-雌二醇可以通過抑制外膜細胞的增殖而減少球囊損傷后血

8、管新生內膜的形成。也有研究報道，通過在血管外膜轉染smad7腺病毒使外膜細胞過表達Smad7，可以抑制TGF-β1通路，從而明顯減弱球囊損傷后成纖維細胞的促新生內膜形成和血管重構的作用。因此，以血管外膜細胞為靶點的血管外膜基因轉染代表了一種新的治療心血管疾病的方法。
　　 綜上所述，我們提出如下假說：miR-21在血管AF和MF中內源性表達，并且miR-21在調控AF和MF的增殖和凋亡方面發(fā)揮著重要作用；通過干預miR-21的表

9、達能有效調控血管AF和MF的增殖和凋亡，并能進一步改善由球囊損傷導致的血管重構。
　　 目的：
　　 1.建立體外肌成纖維細胞模型，檢測并比較miR-21在成纖維細胞和肌成纖維細胞的表達水平。
　　 2.通過調節(jié)成纖維細胞和肌成纖維細胞中miR-21的表達水平，研究miR-21對增殖和凋亡的影響。
　　 3.檢測能否通過干預miR-21的表達影響大鼠髂動脈球囊損傷所致的血管重構。
　　 方法：

10、r>　　 1.成纖維細胞體外培養(yǎng)
　　 取4-6周(120-180克)雄性Wistar大鼠胸主動脈外膜，采用組織貼壁法原代培養(yǎng)外膜成纖維細胞。實驗用第3-6代細胞。
　　 2.細胞試驗分組
　　 (1)為確定TGF-β1誘導AF分化為MF的合適劑量和時間，行RT-PCR反應，用TGF-β1(10 ng/ml)刺激不同的時間：0、6、12、24、36、48小時，分為6組；不同濃度的TGF-β1刺激24小時：0、1

11、、5、10、20、30 ng/ml，分為6組。行Western blot檢測，按照TGF-β1(10 ng/ml)刺激不同的時間：0、12、24、36小時，分為4組。
　　 (2)為檢測細胞內miR-21的表達水平能否被調節(jié)，分為5組：空白對照組、抑制劑陰性對照組、miR-21抑制劑(即miR-2l inhibitor)組、前體陰性對照組和pre-miR-21(即miR-21前體)組。
　　 (3)為檢測細胞的增殖和凋亡

12、，根據干預措施不同分為5組：空白對照組、抑制劑陰性對照組、miR-21抑制劑組、前體陰性對照組和pre-miR-21組。
　　 3.建立肌成纖維細胞模型
　　 肌成纖維細胞由TGF-β1誘導成纖維細胞而成，并經RT-PCR、Western blot和細胞免疫熒光實驗方法鑒定。
　　 4.細胞免疫熒光實驗
　　 將細胞玻片上生長的用(或未用)TGF-β1刺激的成纖維細胞，經固定、0.5％Triton-X10

13、0處理、BSA封閉后，α-SMA和vimentin一抗過夜，用含有FITC和TRITC的二抗液孵育玻片，然后用DAPI染核，最后于熒光顯微鏡下觀察α-SMA和vimentin的表達情況。
　　 5.miRNA轉染
　　 體外培養(yǎng)的細胞用轉染試劑Lipofectamine2000轉染pre-miR-21或miR-21inhibitor分別造成miR-21的過表達或表達抑制，同時分別設陰性對照組。48小時后檢測細胞樣本。實驗

14、中用含FAM熒光標簽的寡核苷酸轉染細胞以確定轉染效率。最終寡核苷酸的終濃度為50 nM。
　　 6.實時定量RT-PCR
　　 使用miRNA提取試劑盒提取用于檢測miR-21表達的細胞總RNA，用含有特異莖環(huán)結構的引物進行逆轉錄，然后TaqMan探針法在ABI7500 PCR儀上檢測miR-21的表達。用于檢測其他指標(如α-SMA)的細胞總RNA的提取使用Trizol法，逆轉錄成cDNA后，采用熒光實時定量的方法在B

15、io-Rad PCR儀上檢測。miR-21的相對表達用U6做內參，α-SMA mRNA等的相對表達以β-actin為內參，并用AACT的方法計算。
　　 7.蛋白印跡分析
　　 利用組織裂解液提取細胞總蛋白。采用BCA法進行蛋白濃度測定。等量的蛋白樣品在SDS-PAGE凝膠上電泳，然后轉膜至PVDF膜上，膜封閉后，一抗過夜，用洗膜液清洗，用HRP結合的二抗孵育。ECL法發(fā)光，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表

16、達量。
　　 8.大鼠髂動脈球囊損傷模型的建立
　　 按照Gabeler報道的方法建立。Wistar大鼠(320-350 g)戊巴比妥麻醉，2 F的導管引入到右髂總動脈，球囊在3-4 atm壓力下來回拉動3次造成內膜損傷。左側未損傷血管作為對照。
　　 9.血管外膜局部孵育寡核苷酸和動物實驗分組
　　 手術后在損傷血管的周圍均勻孵育20％(w/v)的F-127緩釋凝膠200μl，凝膠中含有0.24 mg

17、miR-21 antagomir(用于體內實驗的miR-21的特異抑制劑)或等體積的PBS。實驗動物分為3組：miR-21 antagomir組(凝膠中含有miR-21antagomir，n=15)、損傷組(凝膠中僅含有PBS，n=20)和未損傷組(左側未損傷血管，n=20)。損傷組于手術后1天、3天和21天處死，miR-21 antagomir組于手術后3天和21天處死，分別用于進行增殖檢測(術后3天，n=5)、凋亡檢測(術后1天和3

18、天，n=5)和HE染色(術后21天，n=5)。
　　 10.細胞增殖檢測
　　 細胞轉染pre-miR-21或miR-21 inhibitor后48小時，采用EdU的方法檢測細胞的增殖率。操作按照EdU細胞增殖檢測試劑盒的說明書進行，增殖的細胞EdU染核陽性，用Hoechst33342染細胞核，熒光鏡下觀察高倍視野下細胞EdU陽性數占細胞總數的比例，計算細胞增殖率。
　　 動物實驗中，采用BrdU方法檢測細胞增殖

19、。分別在動物處死前12和24小時各注射BrdU一次。按照說明書操作，使用特異的BrdU抗體檢測組織細胞的增殖率。細胞增殖率按高倍視野中BrdU陽性數占總細胞數的百分比計算。
　　 11.細胞凋亡檢測
　　 細胞轉染后48小時分別采用Annexin-V/7-AAD雙染的方法和Caspase-3活性檢測的方法檢測細胞的凋亡情況。Annexin-V/7-AAD雙染利用流式細胞儀(FACS)進行檢測。Caspase-3活性檢測采

20、用比色法檢測Caspase-3相對活性。
　　 在動物實驗中，按照試劑盒說明，采用TUNEL方法檢測細胞凋亡。細胞的凋亡率按高倍視野中TUNEL陽性數占總細胞數的百分比計算。
　　 12.免疫組織化學
　　 為檢測血管外膜成纖維細胞的分化，取石蠟切片，按照SABC免疫組織試劑盒的操作說明，行免疫組織化學檢測α-SMA的表達。
　　 13.形態(tài)測定分析
　　 通過測定血管組織形態(tài)學的改變來分析血管重

21、構的情況。用HE染色法，對新生內膜/中膜面積(Neointimal/Medial area，N/M)和管腔大小(LUmen Size)進行形態(tài)學分析，用IPP軟件進行測量。
　　 14.統(tǒng)計學分析
　　 所有數據以均數±標準誤計算，來源于3次以上獨立實驗。兩組間的差異用t檢驗，多組間的差異用單因素方差分析。數據用GraphPad Prism5.0軟件分析，P<0.05代表有顯著性差異。
　　 結果：
　　

22、 1.體外用TGF-β1誘導成纖維細胞分化為肌成纖維細胞
　　 RT-PCR和Western blot結果顯示，在蛋白和mRNA水平上，TGF-β1都能顯著促進α-SMA的表達，并呈現一定的時間和濃度依賴性：TGF-β1(10 ng/ml，24小時)能明顯促進α-SMA的表達。細胞免疫熒光實驗研究顯示，經TGF-β1(10 ng/ml，24小時)處理后，細胞共表達vimentin和α-SMA，同時胞漿內形成大量肌絲，表明AF分化

23、為MF，體外建立肌成纖維細胞模型成功。
　　 2.miR-21在AF中內源性表達并且在MF中表達升高
　　 實時定量RT-PCR(探針法)檢測發(fā)現，AF中內源性表達miR-21。相對于AF，MF中miR-21的表達水平明顯升高。
　　 3.調節(jié)miR-21在AF和MF中的表達
　　 為檢測AF和MF中miR-21的表達水平能否被調節(jié)，我們采用了表達抑制和過表達的方法。在AF和MF中，轉染pre-miR-2

24、1后，miR-21的表達水平明顯升高：轉染miR-21抑制劑(miR-21 inhibitor)后，miR-21的表達明顯下降，然而轉染對照核苷酸后miR-21的表達量沒有明顯變化，說明miR-21在AF和MF中的表達水平是可以調節(jié)的。
　　 4.miR-21對AF和MF增殖的作用
　　 EdU增殖檢測分析結果顯示，在AF和MF中，抑制miR-21的表達后，兩種細胞的EdU摻入率減少；轉染pre-miR-21使細胞過表達

25、miR-21后，AF和MF的EdU摻入率減少增加；上述結果表明，miR-21具有促進AF和MF的增殖活性的作用。研究還發(fā)現，無論在基礎水平還是經pre-miR-21干預之后，MF較AF都顯示出更高的增殖活性。
　　 5.miR-21對AF和MF凋亡的作用
　　 Annexin-V/7AAD流式細胞術和Caspase-3活性檢測結果顯示，AF和MF轉染miR-21 inhibitor抑制miR-21表達后，annexin

26、V陽性細胞數和Caspase-3的活性都明顯增加；而過表達miR-21后則出現相反的結果，說明在AF和MF中，miR-21發(fā)揮了為抗凋亡的作用。
　　 6.miR-21抑制劑對球囊損傷的血管的外膜成纖維細胞的增殖和凋亡的影響
　　 免疫組化結果顯示，在球囊損傷術后3天，血管外膜中可見α-SMA陽性細胞，這一結果提示已有部分AF分化為MF。
　　 術后3天，損傷組的血管外膜細胞增殖活性較未損傷組明顯升高；而相對于損

27、傷組，miR-21 antagomir組的血管外膜細胞增殖率明顯下降。
　　 TUNEL結果顯示，未損傷的血管外膜凋亡細胞很少；術后1天，損傷組的外膜可見較多凋亡細胞；術后3天，損傷組外膜中凋亡細胞數明顯下降，與未損傷組無明顯差別；然而，miR-21 antagomir(miR-21抑制劑)組相較于未拉傷組和損傷組(術后3天)，凋亡率明顯升高。
　　 7.miR-21抑制劑對球囊所致的血管重構的影響
　　 為了檢

28、測miR-21抑制劑對球囊損傷所致的血管重構的影響，我們對球囊損傷后21天的血管進行了形態(tài)學的分析。相對于未損傷組，損傷組的血管呈現出明顯的新生內膜形成和管腔的損失；相對于損傷組，miR-21 antagomir組的內膜/中膜面積比(N/M)明顯降低，并且管腔損失程度得到改善。
　　 結論：
　　 1.miR-21在血管成纖維細胞內源性表達，并且在TGF-β1誘導而成的肌成纖維細胞中miR-21表達明顯升高。