芩丹膠囊對(duì)血管外膜成纖維細(xì)胞TGF-β1-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響的研究.pdf

1、背景：心血管的重構(gòu)貫穿于血管內(nèi)膜損傷后再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)、高血壓等多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，是各種病變維持、惡化的病理結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。近年來(lái)，血管外膜在損傷后血管重構(gòu)過(guò)程中所起的作用得到了空前的關(guān)注。研究證明，外膜對(duì)血壓升高的反應(yīng)是最敏感的，并且早于血管中膜和內(nèi)膜，而且外膜的這種變化是高血壓血管結(jié)構(gòu)改變的最早征象之一。血管外膜成纖維細(xì)胞(Adventitial fibroblasts，AF)在

2、血管損傷后發(fā)生增殖、遷移、分泌細(xì)胞外基質(zhì)，是參與血管損傷后新內(nèi)膜形成和血管重塑的重要內(nèi)容。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factorβ1，TGF-β1)是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的功能最為復(fù)雜的生長(zhǎng)因子之一，被公認(rèn)為是影響AF生物功能最直接，也是最重要的細(xì)胞因子。Smad信號(hào)通路是TGF-β1的經(jīng)典下游信號(hào)通路，與眾多組織如心肌、肝臟、肺及腎臟等的纖維化密切相關(guān)。根據(jù)Smad在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用可將其分為三類(lèi)：⑴受體調(diào)節(jié)

3、型Smad(Receptor activated Smad，R-Smad)，包括Smad1、2、3、5、8，為Ⅰ型受體激酶的底物，在特定的TGF-β超家族成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮作用；⑵共同介質(zhì)型Smad(Common Smad，Co-Samd)，主要是Smad4。Smad4被磷酸化后可以與R-Smad形成雜聚體，然后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)；⑶抑制型Smad(Inhibitory Smad，I-Smad)，包括Smad6、7

4、，可以阻斷R-Smad與受體或與Co-Samd的結(jié)合，從而對(duì)Smad信號(hào)通路發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是新興的生物技術(shù)，被Science評(píng)為2002年十大科學(xué)成就之首。RNA干擾是一種由目的基因所對(duì)應(yīng)的小分子雙鏈RNA(Double-stranded，dsRNA)啟動(dòng)的序列特異的基因沉默過(guò)程，從而導(dǎo)致相應(yīng)的mRNA被降解，進(jìn)而阻斷基因的表達(dá)。人工合成的siRNA可特異性地抑制哺乳類(lèi)細(xì)胞中內(nèi)源

5、性或外源性基因的表達(dá)，使相應(yīng)基因保持沉默或休眠狀態(tài)。SiRNA所誘發(fā)的基因抑制具有高效性和高度的序列特異性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察TGF-β1誘導(dǎo)AF生物活性的改變，并用RNA干擾的方法，研究在外膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)合成中TGF-β1/Smad信號(hào)通路的作用機(jī)制，且進(jìn)一步探討Smad2和Smad3在上述過(guò)程中的不同作用。
　　 目的：⑴觀察TGF-β1對(duì)外膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響。⑵

6、探討TGF-β1/Smad信號(hào)通路在外膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)合成中的作用機(jī)制，并研究Smad2和Smad3在這些過(guò)程中的不同作用。
　　 方法：①體外原代成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定：采用組織貼塊法體外原代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈成纖維細(xì)胞。大概3-7天可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊周?chē)莱觯籗ABC法行平滑肌肌動(dòng)蛋白-α(alpha smooth muscle actin，α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒

7、定。取第3-8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。②小干擾RNA鏈的合成、有效濃度的篩選：設(shè)計(jì)并分別合成3條Smad2和Smad3特異性siRNA，同時(shí)合成熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA(FAM-siRNA)1條和Smad2/3非特異性陰性對(duì)照siRNA1條。細(xì)胞密度達(dá)50％-70％時(shí)轉(zhuǎn)染FAM-siRNA。轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡觀察熒光陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，根據(jù)轉(zhuǎn)染效率選擇siRNA和Lipofectamine2000最佳轉(zhuǎn)染濃度。③細(xì)胞轉(zhuǎn)染和小干擾有效鏈的篩

8、選：根據(jù)Lipofectamin2000的轉(zhuǎn)染步驟，用western-blot檢測(cè)各組siRNA的干擾效率，進(jìn)行有效鏈的篩選。④MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力：接種細(xì)胞，按照說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，24 h后，加入含20 ng/ml TGF-β1的正常培養(yǎng)液，繼續(xù)刺激24 h。于刺激結(jié)束前4 h每孔加入MTT，然后吸棄上清，加入DMSO，比色。⑤Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：應(yīng)用6孔板transwell小室行體外遷移實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分組和處理同前

9、，處理過(guò)的細(xì)胞消化后用DMEM制成細(xì)胞懸液，取0.6ml懸液以5×105/ml的密度接種于上室，下室中加入1.5 ml含10％FCS的正常培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)6 h，將上室內(nèi)側(cè)附著的細(xì)胞用濕棉簽擦去，固定，伊紅和蘇木素染色，倒置顯微鏡下隨意取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(×100)。⑥實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)相關(guān)因子mRNA的表達(dá)：細(xì)胞處理同前，采用Trizol法提取總RNA，并在PCR熱循環(huán)儀上將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。觀察基因沉默和TGF-β1處理

10、后，Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ型及Ⅲ型前膠原肽mRNA的表達(dá)。采用2-△△Ct方法對(duì)mRNA表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。⑦Western-blot檢測(cè)相關(guān)因子蛋白的表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)染24 h后，加入TGF-β1孵育24 h，提取蛋白并定量，western-blot檢測(cè)p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ型前膠原肽蛋白表達(dá)。⑧統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)資料均采用SP

11、SS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，組間差異采用one-way ANOVA分析和，檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：⑴貼壁3-7d后可見(jiàn)細(xì)胞從不同的組織塊邊緣爬出，取第3代細(xì)胞，用α-SMA和Vimentin行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陽(yáng)性率達(dá)100％。⑵SiRNA轉(zhuǎn)染并經(jīng)TGF-β1刺激后，干擾組Smad2或Smad3蛋白的表達(dá)較單純刺激組下降80％以上。且小干擾具有高度特異性和選擇性，即siRNA-Sm

12、ad3只降低Smad3蛋白的表達(dá)，而對(duì)Smad2蛋白的表達(dá)沒(méi)有影響，同樣siRNA-Smad2只作用于Smad2，而對(duì)Smad3蛋白表達(dá)沒(méi)有作用。⑶與正常對(duì)照組相比，TGF-β1刺激組增殖顯著增強(qiáng)(P<0.01)；Smad2基因被干擾之后，細(xì)胞增殖較單純TGF-β1刺激組減弱(P<0.01)?；虺聊琒mad2能顯著抑制成纖維細(xì)胞的增殖能力。⑷Smad3基因被沉默后，細(xì)胞增殖能力較TGF-β1刺激組減弱(P<0.01)。SiRNA介導(dǎo)的

13、Smad3表達(dá)下調(diào)可以顯著抑制成纖維細(xì)胞的增殖。⑸SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能顯著抑制成纖維細(xì)胞的增殖，但兩者差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。⑹與正常對(duì)照組相比，TGF-β1刺激后細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)(P<0.01)；下調(diào)Smad2基因表達(dá)之后，細(xì)胞遷移較TGF-β1刺激組減弱(P<0.01)。基因沉默Smad2能顯著抑制成纖維細(xì)胞的遷移能力。⑺Smad3基因被沉默后，細(xì)胞遷移能力較TGF-β1刺激組減弱(P<

14、0.01)。SiRNA介導(dǎo)的Smad3表達(dá)下調(diào)亦可以顯著抑制成纖維細(xì)胞的遷移能力。⑻SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能顯著抑制成纖維細(xì)胞遷移能力，然而兩者之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。⑼經(jīng)TGF-β1刺激后，Smad2、Smad3、α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)均較正常組顯著增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01)，而Smad7 mRNA表達(dá)則無(wú)顯著差異(P>0.05)。SiRNA介導(dǎo)Smad2表達(dá)下調(diào)后，與T

15、GF-β1刺激組相比，α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，Smad7 mRNA表達(dá)則無(wú)顯著差異(P>0.05)。⑽Smad3基因被沉默后，α-SMA，Ⅰ及Ⅲ型前膠原mRNA較TGF-β1刺激組減弱，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。Smad7 mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。⑾SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能顯著α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型

16、前膠原mRNA表達(dá)，但兩者之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。⑿經(jīng)TGF-β1刺激后，Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA、Ⅰ型前膠原蛋白表達(dá)均較正常組顯著增強(qiáng)(P<0.01)，而Smad7蛋白表達(dá)則無(wú)顯著差異(P>0.05)。SiRNA介導(dǎo)Smad2表達(dá)下調(diào)后，與TGF-β1刺激組相比，p-Smad2、α-SMA、Ⅰ型前膠原蛋白表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，Smad7

17、蛋白表達(dá)則無(wú)顯著差異(P>0.05)。⒀Smad3基因被沉默后，p-Smad3、α-SMA、Ⅰ型前膠原蛋白較TGF-β1刺激組減弱，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Smad7蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。⒁SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能顯著α-SMA，Ⅰ型前膠原蛋白表達(dá)，但兩者之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：①實(shí)驗(yàn)中所選用siRNA可以高效并特異地阻斷Smad2或Smad3的表