IQGAP1在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制探討.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病是臨床上一種常見內(nèi)分泌性疾病，它是由于多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌和（或）作用缺陷所致。持續(xù)高血糖與長期代謝紊亂等可導(dǎo)致全身組織器官的多種并發(fā)癥，尤其是眼、腎、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)的慢性進(jìn)行性病變、功能減退或衰竭。糖尿病的全身血管并發(fā)癥分為大血管并發(fā)癥和微血管并發(fā)癥，糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，其臨床表現(xiàn)主要為高血

2、壓、水腫、嚴(yán)重蚩白尿、低白蛋白血癥和進(jìn)行性腎功能減退;腎臟病理主要表現(xiàn)為結(jié)節(jié)狀或彌漫性系膜細(xì)胞增殖、基底膜(GBM)增厚，系膜細(xì)胞外基質(zhì)積聚、足細(xì)胞足突融合，腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化。糖尿病腎病是目前世界范圍內(nèi)導(dǎo)致終末期腎病(endstage renal disease，ESRD)的首位位病因，增加各國衛(wèi)生保健事業(yè)支出的同時(shí)也給予社會(huì)、家庭、個(gè)人帶來沉重負(fù)擔(dān)。在我國糖尿病腎病發(fā)病率以及在終末期腎衰竭透析患者中所占的比例也成逐年增加趨

3、勢(shì)，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。因此，探討糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制、及早發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病并給予適當(dāng)干預(yù)治療措施對(duì)廣大糖尿病腎病患者具有重要的社會(huì)和現(xiàn)實(shí)意義。DN的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及到糖脂代謝紊亂、炎癥介質(zhì)釋放、血流動(dòng)力學(xué)異常、細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡等多因素的作用。近年來的研究顯示，腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)和功能的改變，尤其是作為腎小球?yàn)V過屏障重要組成成分的足細(xì)胞損傷，在糖尿病腎病的進(jìn)展中發(fā)揮了舉足輕重的作用，被認(rèn)為是引起DN蛋白尿和腎小球

4、硬化的關(guān)鍵因素。因此，研究足細(xì)胞的損傷為DN的預(yù)防和治療帶來了新的契機(jī)。
　　足細(xì)胞又稱為臟層腎小球上皮細(xì)胞，附著于腎小球基底膜外側(cè)，與腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)、內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障。足細(xì)胞的主要作用是對(duì)蛋白質(zhì)的濾過及GBM成分的更新起著舉足輕重的作用。由于足細(xì)胞是高度分化細(xì)胞，增殖能力較差，當(dāng)足細(xì)胞受到損傷時(shí)，尿蛋白漏出增加，從而加重腎衰竭的發(fā)生，而蛋白尿又進(jìn)一步

5、加重足細(xì)胞的損傷。
　　在DN的發(fā)生發(fā)展中，足細(xì)胞的改變主要包括足細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞凋亡增加，流動(dòng)性增強(qiáng)，直至足細(xì)胞從GBM上脫落隨尿液排出，導(dǎo)致GBM裸露，形成局灶粘連和腎小球硬化。DN足細(xì)胞損傷機(jī)制復(fù)雜，其不是單由某個(gè)因素所誘發(fā)，而是多個(gè)因素的聯(lián)合作用。主要包括腎蛋白(nephrin)、高血糖、整合素、機(jī)械應(yīng)力、炎性反應(yīng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的激活、AGEs的蓄積、GH-胰島素樣生長因子(insulin-l

6、ike growth factor，IGF)-Ⅰ軸、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、類肝素硫酸蛋白聚糖(HSPG)、腫瘤抑制基因(wT1)、Podocalyxin蛋白、過氧化物酶體增殖物激活受體(perox-isome proliferatoractivatedreceptor，PPAR)、脂聯(lián)素、微小RNA(micro RNA，miRNA)、TGF-β1、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等。
　　有研究顯示，IQ結(jié)構(gòu)域GTP酶活化蛋白Ⅰ(IQ

7、domain GTPase-activatingprotein1，IQGAP1)是一種含有多個(gè)蛋白結(jié)合域的支架蛋白，近期研究發(fā)現(xiàn)IQGAP1在細(xì)胞黏附遷移、維持細(xì)胞形態(tài)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等眾多生命過程中發(fā)揮了舉足輕重的作用[1，2]。
　　IQGAP1是否參與高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡尚未見報(bào)道，基于上述理論基礎(chǔ)，我們?cè)O(shè)計(jì)并進(jìn)行了本次研究。本課題分為兩部分，第一步部分，采用體外培養(yǎng)人腎臟足細(xì)胞(HPC)，觀察高糖刺激對(duì)IQGAP1表達(dá)和分

8、布以及對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響。第二部分，進(jìn)一步觀察IQGAP1與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路以及腎素血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在足細(xì)胞凋亡中的作用，探討高糖誘導(dǎo)腎臟足細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，從而為更好的治療糖尿病腎病提供理論支持。
　　第一部分高糖刺激對(duì)足細(xì)胞中IQGAP1表達(dá)和分布以及凋亡的影響
　　研究目的:
　　1、觀察人腎臟足細(xì)胞在體外高糖刺激下 IQGAP1表達(dá)情況;
　　2、觀察人腎臟足細(xì)胞

9、在體外高糖刺激下 IQGAP1分布情況;
　　3、觀察人腎臟足細(xì)胞在體外高糖刺激下細(xì)胞凋亡情況。
　　研究方法:
　　HPC在33℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中，以含有10％胎牛血清及γ-干擾素(10 U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞使其增殖，傳代后更換為不含γ-干擾素的RPMI1640培養(yǎng)液，置入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14天，促進(jìn)細(xì)胞分化成熟，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。HPC被隨機(jī)分為3組:A組:正常對(duì)照組(N

10、ormal Control，NC，)、B組:甘露醇對(duì)照組(Manitol+Glucose Control，MG)和C組:高糖組(HighGlucose，HG)。NC組細(xì)胞給予D-glucose5.5mmol/L，為了控制高滲透壓對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能帶來的影響，MG組給予D-glucose5.5mmol/L+24.5mol/L甘露醇作為對(duì)照，HG組給予D glucose30mmol/L。各組細(xì)胞同步培養(yǎng)0、12、24、48、72小時(shí)后分別收

11、集，應(yīng)用免疫熒光法觀察IQGAP1在各組環(huán)境足細(xì)胞中的表達(dá)及其分布情況，real-time PCR法檢測(cè)IQGAP1mRNA在各組不同環(huán)境下足細(xì)胞中的表達(dá)情況。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。
　　研究結(jié)果:
　　1、從Fig.1-1可以看出IQGAP1在足細(xì)胞的胞漿與細(xì)胞核中都有表達(dá)，但主要存在于細(xì)胞核內(nèi);
　　2、Fig.1-2、Fig.13A、3B、3C顯示，在0小時(shí)，正常對(duì)照組、甘露醇對(duì)照組和高糖組IQGAP

12、1的表達(dá)量無顯著性差異;在48小時(shí)，免疫熒光顯示:甘露醇組與正常糖組比較，IQGAP1的表達(dá)量變化不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在高糖刺激下，IQGAP1的表達(dá)水平明顯下調(diào)，IQGAP1的表達(dá)量與正常糖對(duì)照組比較明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　3、Fig.1-4A、B、C、D顯示，流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞凋亡，將位于右下象限的早期凋亡細(xì)胞和位于右上象限的晚期凋亡細(xì)胞之和記錄為凋亡細(xì)胞。0小時(shí)，正常糖組凋亡率1.73％±0.13％，甘露醇

13、組凋亡率2.1％±0.15％，高糖組凋亡率2.1％±0.12％，各組凋亡率無顯著性差異(P＞0.05);24小時(shí)，正常糖組凋亡率26.39％±4.57％，甘露醇組凋亡率30.44％±5.15％，高糖組凋亡率56.15％±6％;在48小時(shí)，正常糖組足細(xì)胞凋亡率37.76％±5.6％，甘露醇組凋亡率36.77％±4.27％，高糖組凋亡率68.9％±6.64％。與正常糖組比較，甘露醇組凋亡率無顯著性變化，高糖組凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

14、(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、在正常糖組、甘露醇組和高糖組三組的足細(xì)胞培養(yǎng)中，IQGAP1在胞漿與細(xì)胞核中均有表達(dá)，但主要存在于細(xì)胞核內(nèi);
　　2、高糖可以顯著下調(diào)IQGAP1的表達(dá)，且隨時(shí)間的延長下調(diào)表達(dá)進(jìn)一步加劇;
　　3、高糖可以顯著提升足細(xì)胞的凋亡，且隨時(shí)間的延長凋亡率逐漸增加。
　　第二部分 IQGAP1在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制探討
　　研究目的:
　　1、通過流

15、式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀察人腎臟足細(xì)胞在體外高糖刺激下細(xì)胞凋亡情況以及探討與IQGAP1的關(guān)系;
　　2、通過RT-PCR、Western blotting觀察IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討IQGAP1與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路中p-ERK1/2、ERK1/2的關(guān)系以及在足細(xì)胞凋亡中的作用;
　　3、觀察在高糖組足細(xì)胞培養(yǎng)巾加入貝那普利（10μmol/L）后IQGAP1、p-ERK1

16、/2、ERK1/2的蛋白表達(dá)情況以及細(xì)胞凋亡情況，進(jìn)一步探討IQGAP1與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的作用關(guān)系，以及在足細(xì)胞凋亡中的作用;
　　4、觀察在高糖組足細(xì)胞培養(yǎng)中加入ERK1/2的特異性抑制劑u0126(10μmol/L)后IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2的蛋白表達(dá)情況以及細(xì)胞凋亡情況，進(jìn)一步探討IQGAP1在足細(xì)胞凋亡中的作用。
　　研究方法:
　　將上述在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14天

17、后成熟HPC隨機(jī)分為5組(A-E組):A組:正常糖對(duì)照組(5.5mmol/L glucose，NC)、B組:甘露醇對(duì)照組（24.5mmol/L甘露醇+5.5mmol/L glucose，MG）、C組:高糖組(30mmol/L glucose，HG)、D組:貝那普利組(30 mmol/L glucose+10μmol/L benazepril)、E組:u0126抑制劑組（30 mmol/L glucose+10μmol/L u0126）。

18、各組細(xì)胞同步培養(yǎng)0h、12h、24h、48h、72h時(shí)后收集，應(yīng)用免疫熒光法觀察IQGAP1在各組環(huán)境足細(xì)胞中的表達(dá)及其分布情況，real-time PCR、Western blotting檢測(cè)IQGAP1mRNA及蛋白在不同環(huán)境下足細(xì)胞中的表達(dá)情況。通過Western blot法檢測(cè)ERK1/2和P-ERK1/2的含量。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。
　　研究結(jié)果:
　　1、HG抑制了IQGAP1的表達(dá)，增加P-ERK

19、1/2的表達(dá)，并且促進(jìn)了HPC的凋亡;
　　2、貝那普利可以減輕高糖引起的IQGAP1抑制，上調(diào)IQGAP1的表達(dá)，下調(diào)P-ERK1/2水平。48小時(shí)，D組凋亡率50.54％±6.25％，比C組凋亡率68.9％±6.64％明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明貝那普利可以減輕引起高糖引起的HPC的凋亡;
　　3、U0126對(duì)高糖引起的IQGAP1的抑制沒有影響。48小時(shí)，E組凋亡率3.19％±1.68％，比C組凋亡率68.9％±6

20、.64％明顯下降，提示U0126可顯著減少HPC的凋亡率。
　　結(jié)論:
　　1、高糖通過下調(diào)IQGAP1的表達(dá)、增加p-ERK蛋白表達(dá)，促進(jìn)HPC細(xì)胞的凋亡;
　　2、貝那普利可上調(diào)IQGAP1的表達(dá)，減輕高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;
　　3、U0126抑制劑可減輕高糖引起的足細(xì)胞凋亡，但對(duì)高糖引起的IQGAP1的抑制沒有影響;
　　4、IQGAP1通過與ERK1/2 MAPK信號(hào)通路、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)