MAPKs通路在高糖誘導(dǎo)SD乳鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的:
　　糖尿病心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病心肌病最重要的病理變化之一，促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)鏈?zhǔn)钦婧松镄盘?hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的絲/蘇氨酸蛋白激酶。它是缺血、缺氧、激素作用、生長因子及細(xì)胞因子等各種細(xì)胞外刺激誘導(dǎo)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖等核反應(yīng)的共同通路或匯聚點(diǎn)，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)利用原代培養(yǎng)的乳鼠

2、心肌細(xì)胞為模型，研究高糖對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響及分子通路機(jī)制和MAPK通路阻斷劑的抗心肌細(xì)胞凋亡作用，旨在探索糖尿病性心肌病藥物防治的新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1、心肌細(xì)胞的培養(yǎng):無菌條件下取新生1-3天的Sprague-Dawley(SD)大鼠，取心尖，剪碎成約1mm3大小，應(yīng)用0.1％的胰酶、0.04％的膠原酶Ⅱ的混合酶消化液分離心肌細(xì)胞，10％胎牛血清中和終止消化，應(yīng)用差速貼壁法獲取心肌細(xì)胞，置于37℃、5％C02的培養(yǎng)

3、箱培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入Brdu抑制成纖維細(xì)胞生長，每48小時(shí)更換培養(yǎng)基。倒置相差顯微鏡觀察心肌細(xì)胞形態(tài)，0.4％臺(tái)盼藍(lán)染色檢查心肌細(xì)胞成活率，免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定心肌細(xì)胞純度。
　　2、分組:將培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為7組:對(duì)照組，葡萄糖濃度為5.5mmol/L;高糖組，葡萄糖濃度為25mmol/L;高滲對(duì)照組:對(duì)照組+19.5mmol/L的D-甘露醇;DMSO組:高糖組+1μl/ml的DMSO預(yù)處理30分鐘;SB203580組:

4、高糖組+P38抑制劑SB203580預(yù)處理細(xì)胞30分鐘;PD98059組:高糖組+ERK抑制劑PD98059預(yù)處理細(xì)胞30分鐘;SP600125組:高糖組+JNK抑制劑SP600125預(yù)處理細(xì)胞30分鐘;
　　3、檢測(cè)指標(biāo):干預(yù)72h后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞凋亡率，Westernblot檢測(cè)凋亡指標(biāo)caspase-3蛋白的表達(dá)變化及p-JNK，p-P38蛋白表達(dá)的變化。
　　4、數(shù)據(jù)分析:所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±

5、s)表示，統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用SPSS13.0軟件。采用單因素方差分析及q檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩比較。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以P＜0.01作為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、應(yīng)用混合酶多次消化法，差速貼壁，成功地培養(yǎng)出純度較高的心肌細(xì)胞，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定為陽性。
　　2、流式細(xì)胞儀結(jié)果:與對(duì)照組相比，高滲組凋亡率無明顯變化(P＞0.05);高糖組的細(xì)胞凋亡明顯增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

6、01);PD98059組及DMSO組較高糖組細(xì)胞凋亡無明顯變化(P＞0.05)，SP600125組及SB203580組較高糖組細(xì)胞凋亡均減少(p＜0.01)。
　　3、Caspase-3表達(dá)結(jié)果:與對(duì)照組相比，高滲組的caspase-3表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)，而高糖組Caspase-3表達(dá)增多(P＜0.01);與高糖組相比,PD98059組細(xì)胞caspase-3表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)，SP600125及SB2035

7、80組caspase-3表達(dá)均減少(P＜0.01)。
　　4、JNK表達(dá)結(jié)果:與對(duì)照組相比，高滲組p-JNK表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)，高糖組p-JNK明顯表達(dá)增多(P＜0.01);SP600125組較高糖組p-JNK表達(dá)明顯較少(P＜0.01);
　　5、P38表達(dá)結(jié)果:與對(duì)照組相比，高滲組p-P38表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)，高糖組p-P38表達(dá)明顯增多(P＜0.01)，SB203580組p-P38較高糖組表達(dá)明