Trx-ASK1在Doxorubicin誘導的乳鼠心肌細胞凋亡中的作用.pdf

1、第一部分 Doxorubicin誘導乳鼠心肌細胞凋亡以及抗氧化劑Ebselen的保護作用
　　目的：
　　通過給予doxorubicin體外誘導乳鼠心肌細胞發(fā)生凋亡，并檢測這一過程中Caspase3、PARP-1的活化，給予抗氧化劑Ebselen后是否可以抑制doxorubicin誘導的凋亡。
　　方法：
　　一、培養(yǎng)第四天的乳鼠心肌細胞給予不同濃度的doxorubicin作用24h，MTT法檢測心肌細胞的存活率

2、;凋亡試劑盒檢測caspase3的活性；western-blot法檢測Cleaved PARP-1的表達。實驗分組為：1、正常組(Con)：正常培養(yǎng)24h；2、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L DOX組：正常細胞分別給予上述濃度DOX培養(yǎng)24h。
　　二、培養(yǎng)第四天的乳鼠心肌細胞預孵育Ebselen2 h,給予1μmol/L DOX作用24h，MTT法檢測心肌細胞的存活率;細胞內(nèi) ROS含量檢

3、測；細胞凋亡熒光Hochest33258試劑盒進行凋亡檢測；凋亡試劑盒檢測caspase3的活性；western-blot法檢測PARP-1、Cleaved PARP-1的表達。實驗分組：1、正常組(Con)：正常培養(yǎng)24h；2、1μmol/L DOX組：正常細胞給予1μmol/L DOX培養(yǎng)24h；3、1μmol/L DOX+50μmol/L Ebselen組：預孵育50μmol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX作用

4、24h;4、給予50μmol/L Ebselen24h。結果：
　　1.乳鼠心肌細胞給予不同濃度的doxorubicin作用24 h后，MTT法檢測心肌細胞的存活率呈現(xiàn)劑量依賴性，1μmol/L與5μmol/L DOX組 MTT值下降，與對照組MTT值比較均有顯著差異（P<0.01）。
　　2.24h后檢測胞漿caspase3活性,與con組相比，1μmol/L DOX組caspase3活化度為151.23±10.41％（P

5、<0.01）;5μmol/L DOX組caspase3活化度為161.03±12.21%（P<0.01）。
　　3.24h后檢測Cleaved PARP-1的表達。與con組相比，1μmol/L和5μmol/L DOX組Cleaved PARP-1表達明顯增加（P<0.001）。
　　4.預孵育50μmol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX。24h后，檢測細胞活力。1μmol/L DOX組MTT值下降，與對

6、照組MTT值比較有顯著差異（P<0.01）；Ebselen可以顯著抑制 DOX對細胞的損傷，與 DOX組比較 MTT值比較有顯著差異（P<0.05）。
　　5.預孵育50μmol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX。24h后，加入熒光探針H2DCFDA孵育30 min清洗后觀察，DOX組比con組細胞內(nèi)單位面積熒光強度顯著增強，證實有ROS的減產(chǎn)生，給予Ebselen后，ROS含量減少。
　　6.預孵育50μ

7、mol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX。24h后，Hochest33258熒光染色。con組細胞呈低藍色，1μmol/L DOX組細胞呈高藍色，亮度明顯增高，可觀察到明顯的細胞核固縮，具有凋亡的顯著特征，與DOX組相比，Ebselen組凋亡有所改善。
　　7.預孵育50μmol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX24h后，檢測胞漿caspase3活性。與con組相比，1μmol/L DOX組ca

8、spase3活化度為171.04±10.41%（P<0.01）;與DOX組相比，Ebselen可以顯著抑制caspase3的活化125.04±6.41%，（P<0.05）。
　　8.預孵育50μmol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX24h后，檢測Cleaved PARP-1的表達。與con組相比，1μmol/L DOX組Cleaved PARP-1表達明顯增加（P<0.001）;與DOX組相比，Ebselen組

9、Cleaved PARP-1表達明顯減少（P<0.01）。
　　結論：
　　給予 DOX作用乳鼠心肌細胞，細胞的存活率呈現(xiàn)劑量依賴性；細胞內(nèi) ROS含量顯著增加；形態(tài)學觀察到顯著的凋亡特征；Caspase3活性顯著升高；PARP-1蛋白的剪切片段表達較正常組顯著增加，給予抗氧化劑Ebselen后，與DOX組相比，凋亡得到了改善。
　　第二部分 Doxorubicin誘導的乳鼠心肌細胞凋亡的機制研究
　　目的：

10、r>　　檢測DOX誘導心肌細胞凋亡過程中Trx-ASK1是否發(fā)生了分離；以及發(fā)生分離后ASK1是否發(fā)生了活化，并進而啟動ASK1介導的凋亡信號通路。
　　方法：
　　一、培養(yǎng)第四天的乳鼠心肌細胞預孵育Ebselen2h,給予1μmol/L DOX作用24h,免疫沉淀法檢測Trx-ASK1的結合率。實驗分組為：1、正常組(Con)：正常培養(yǎng)24h；2、1μmol/L DOX組：正常細胞給予1μmol/L DOX培養(yǎng)24h；3、

11、1μmol/L DOX+50μmol/L Ebselen組：預孵育50μmol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX作用24h;4、給予50μmol/L Ebselen24h。
　　二、培養(yǎng)第四天的乳鼠心肌細胞預孵育Ebselen2h,給予1μmol/L DOX作用24h，western-blot法檢測p-ASK1、p-p38、p38的表達。。實驗分組：1、正常組(Con)：正常培養(yǎng)24h；2、1μmol/L DOX

12、組：正常細胞給予1μmol/L DOX培養(yǎng)24h；3、1μmol/L DOX+50μmol/L Ebselen組：預孵育50μmol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX作用24h;4、給予50μmol/L Ebselen24h。
　　結果：
　　1.心肌細胞給予1μmol/L DOX作用后，與正常組比較Trx-ASK1發(fā)生了顯著的分離（P<0.001）；與1μmol/L DOX組相比，1μmol/L DOX+

13、50μmol/L Ebselen組Trx-ASK1分離顯著減少（P<0.05）。
　　2.心肌細胞給予1μmol/L DOX作用后，與正常組比較p-ASK1ser967的表達顯著減少(P<0.01），與 DOX組相比，1μmol/L DOX+50μmol/L Ebselen組p-ASK1ser967表達顯著增加（P<0.01）。
　　3.心肌細胞給予1μmol/L DOX作用后，與正常組比較 p-p38表達顯著增加（P<0.