細(xì)胞自噬在β1-腎上腺素受體自身抗體誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、心功能不全是冠狀動脈性心臟病、心肌梗死、心絞痛和心率失常等各種心血管疾病的終末階段，盡早進行預(yù)防以及治療對心血管疾病的預(yù)后有著十分重大的意義。大量研究發(fā)現(xiàn)，心功能不全早期廣泛存在的心肌細(xì)胞凋亡，在心功能不全發(fā)生發(fā)展的進程中起著舉足輕重的作用。但是，心功能不全過程中導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的機制并不十分清楚。近年來的臨床研究顯示，40％-60%的心功能不全患者血清中可以檢測到β1腎上腺素受體自身抗體（β1-adrenergic receptor

2、autoantibody，β1-AA），后者可以通過與β1-腎上腺素受體（β1-adrenergic receptor，β1-AR）細(xì)胞外第二環(huán)（β1-AR-ECII）結(jié)合誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。然而，β1-AA如何引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡目前還不很清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，β1-AA可以引起心肌細(xì)胞自噬水平發(fā)生下降。他人的研究發(fā)現(xiàn)，自噬和細(xì)胞凋亡可以在一個細(xì)胞中共存，參與細(xì)胞自穩(wěn)的調(diào)控；在某些情況下，自噬作為應(yīng)激反應(yīng)，可以通過抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡從而保護

3、細(xì)胞免于死亡。因此，細(xì)胞自噬可能在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮非常重要的調(diào)控作用。然而，β1-AA導(dǎo)致自噬水平的降低與β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡之間是否相關(guān)并不清楚。
　　因此，本研究使用β1-AR-ECII抗原肽段，主動免疫雄性Wistar大鼠，第8周時用親和層析法提純動物血清中的β1-AA，作用于H9c2心肌細(xì)胞以及原代乳鼠心肌細(xì)胞進行實驗研究。通過Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst33258染色以及Casp

4、ase-3的活性檢測這三種方法來反映心肌細(xì)胞凋亡情況；采用CCK-8法檢測心肌細(xì)胞死亡程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡參與了心肌細(xì)胞的死亡。此外，本研究還運用Western blot及Real-time PCR方法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3， Beclin1和P62的表達(dá)，結(jié)果顯示β1-AA在早期可以誘導(dǎo)自噬水平短暫升高，隨后出現(xiàn)明顯降低。為了進一步觀察心肌細(xì)胞自噬水平的降低在β1-AA誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用，本實驗采用自

5、噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）對自噬進行抑制，以及使用mTOR通路抑制劑雷帕霉素（Rapamycin, Rapa）上調(diào)自噬后進一步觀察心肌細(xì)胞凋亡水平的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬的下降促進了β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，并進一步探討了可能的線粒體機制。本研究旨在從自噬的角度探討β1-AA誘導(dǎo)凋亡的可能機制，為改善心功能不全患者的預(yù)后及疾病進展提供一定的實驗依據(jù)。
　　目的：
　　本研究通過使用β1

6、-AA建立細(xì)胞模型，探討細(xì)胞自噬發(fā)生的改變在β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用。
　　方法：
　　（1）抗體的制備：
　　使用公司合成的β1-AR細(xì)胞外第二環(huán)肽段作為主疫用抗原肽段去主動免疫8周齡的Wistar大鼠。將大鼠隨機分成兩組：①免疫組：β1-AR-ECII抗原肽段以0.4μg/g的劑量主動免疫大鼠；②溶劑對照組也稱偽免疫組。第一次主動免疫時使用完全弗氏佐劑，以后每兩周加強免疫一次，換為不完全弗氏佐劑。免疫8

7、w后進行腹主動脈取血，SA-ELISA法檢測血清中β1-AA的抗體滴度，使用親和層析法對血中的β1-AA進行提純，用于細(xì)胞實驗。
　?。?）細(xì)胞水平的研究：
　　將細(xì)胞（H9c2心肌細(xì)胞以及原代心肌細(xì)胞）隨機分成兩組，分別是β1-AA組和陰性IgG對照組。β1-AA組即終濃度為1μM的β1-AA處理細(xì)胞不同時間，對照組則以相同劑量的陰性IgG進行同等條件處理。心肌細(xì)胞的存活率本實驗中使用CCK-8法進行檢測，心肌細(xì)胞凋亡情況

8、使用Caspase-3試劑盒監(jiān)測Caspase-3的活性、Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)直接監(jiān)測凋亡率以及Hoechst33258染色法致密藍(lán)染凋亡細(xì)胞，而心肌細(xì)胞自噬水平則使用常規(guī)的RT-PCR法及Western blot的方法對自噬相關(guān)基因和蛋白進行測定。分別使用Caspase廣譜抑制劑Z-VAD-FMK對凋亡進行抑制，經(jīng)典自噬抑制劑3-MA和mTOR通路抑制劑Rapa抑制和上調(diào)自噬，觀察減少細(xì)胞凋亡以及改變細(xì)胞的

9、自噬水平后心肌細(xì)胞死亡的變化情況。使用3-MA和 Rapa對心肌細(xì)胞進行預(yù)處理，下調(diào)和上調(diào)自噬水平，采用 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst33258染色、Caspase-3活性改變以及JC-1染色情況觀察心肌細(xì)胞凋亡情況的改變。
　　結(jié)果：
　　1.β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡參與了心肌細(xì)胞死亡
　　1.1常規(guī)復(fù)蘇以及傳代培養(yǎng)后的H9c2心肌細(xì)胞可用于后續(xù)實驗
　　37oC水浴鍋中

10、迅速融化凍存液并以800 rmp的速度離心細(xì)胞，棄去上清凍存液，使用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶，孵箱培養(yǎng)，待其密度達(dá)到約80%，0.25%不含有EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞進行傳代，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)便于后續(xù)實驗使用。1.2分離培養(yǎng)的原代乳鼠心肌細(xì)胞活性好，純度高，藥物反應(yīng)敏感
　　使用提前配置的濃度為0.4%的臺盼藍(lán)染液對剛分離的原代細(xì)胞的存活率進行檢測，經(jīng)檢測，其存活率高達(dá)90%；待細(xì)胞生長4天后，采用心肌細(xì)胞標(biāo)志物α-橫紋肌肌

11、動蛋白（α-actin）及心肌肌鈣蛋白I（cTnI）對所分離的細(xì)胞進行免疫熒光染色鑒定，結(jié)果證明分離的心肌細(xì)胞純度高達(dá)92.64%；使用臨床常用藥物異丙腎上腺素和去甲腎上腺素刺激原代乳鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對兩種藥物的反應(yīng)敏感。
　　1.3主動免疫大鼠血清中提純的β1-AA能夠增加乳鼠心肌細(xì)胞的跳動頻率
　　采用SA-ELISA方法檢測主免大鼠6周后大鼠血清中β1-AA的OD值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其OD值高達(dá)1.93±0.26，提純后濃

12、度高達(dá)6.4 mg/mL。將β1-AA作用于培養(yǎng)4天的原代心肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1μM的β1-AA作用于原代心肌細(xì)胞24 h及48 h后心肌細(xì)胞的跳動頻率明顯增加，表明主免大鼠后其血清中提純的β1-AA具有活性，能夠增加乳鼠心肌細(xì)胞的跳動頻率。
　　1.4β1-AA可以降低心肌細(xì)胞的存活率
　　采用CCK-8法反映β1-AA對心肌細(xì)胞存活率造成的影響。結(jié)果顯示β1-AA刺激心肌細(xì)胞48 h，心肌細(xì)胞存活率下降最為顯著。
　

13、　1.5β1-AA能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡
　　使用Caspase-3活性檢測，Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33258染色檢測細(xì)胞凋亡情況的變化。三種方法檢測結(jié)果類似，顯示β1-AA作用于心肌細(xì)胞6 h，心肌細(xì)胞的凋亡顯著增加，說明β1-AA能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。1.6采用Caspase的廣譜抑制劑Z-VAD-FMK抑制凋亡后可以部分逆轉(zhuǎn)β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡
　　用Caspase的

14、廣譜抑制劑Z-VAD-FEK對心肌細(xì)胞進行30 min預(yù)處理，再使用β1-AA刺激心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示Z-VAD-FEK可以部分逆轉(zhuǎn)β1-AA誘導(dǎo)的Caspase-3活性增加、減少β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡。這一結(jié)果提示，β1-AA誘發(fā)的細(xì)胞凋亡參與了其細(xì)胞損傷作用。
　　2.β1-AA引起心肌細(xì)胞自噬水平變化的時間規(guī)律及其在心肌細(xì)胞死亡中的意義
　　2.1β1-AA誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的自噬出現(xiàn)先增高后降低的趨勢
　　采用R

15、eal time-PCR法及Western blot法測定β1-AA干預(yù)H9c2心肌細(xì)胞0 h、3 h、6 h、12 h、24 h后自噬相關(guān)蛋白LC3的mRNA水平以及LC3、Beclin1和P62蛋白表達(dá)情況；分離原代乳鼠心肌細(xì)胞，用β1-AA刺激0 min，1min，3 min，5 min，10 min，20 min，30min，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h，36 h，48 h和72 h后檢測LC3的 mRNA水平以及

16、LC3、Beclin1和P62蛋白表達(dá)情況。結(jié)果均提示β1-AA可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬水平出現(xiàn)先增高后降低的趨勢。
　　2.2自噬水平降低是β1-AA引起心肌細(xì)胞死亡的重要原因
　　分別采用3-MA和Rapa預(yù)處理心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)3-MA預(yù)處理致自噬水平下調(diào)后心肌細(xì)胞的存活率與β1-AA單獨處理組的心肌細(xì)胞相比進一步下降；而Rapa預(yù)處理上調(diào)自噬水平后心肌細(xì)胞的存活率部分恢復(fù)。提示我們自噬水平下降參與了β1-AA引起的心肌細(xì)胞死

17、亡。
　　3.自噬的下降在β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用研究
　　3.1 Rapa上調(diào)或3-MA下調(diào)心肌細(xì)胞自噬水平可以明顯改變β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡
　　檢測Caspase-3活性變化，Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)觀察凋亡率改變以及Hoechst33258染色法藍(lán)染凋亡細(xì)胞核。結(jié)果顯示3-MA+β1-AA組與單獨β1-AA處理組心肌細(xì)胞相比，凋亡率進一步提高，這表明抑制自噬可增加心肌細(xì)

18、胞的凋亡。而Rapa+β1-AA組與單獨β1-AA處理組心肌細(xì)胞相比，細(xì)胞凋亡率顯著下降，表明上調(diào)自噬可減少原代心肌細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果都提示自噬水平的降低參與β1-AA引起的心肌細(xì)胞凋亡。
　　3.2降低的自噬能夠促進β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體途徑的凋亡
　　JC-1熒光染色顯示的紅綠熒光強度以及Caspase-9活性的改變與線粒體凋亡密切相關(guān)。兩種方法結(jié)果顯示，3-MA預(yù)處理組與β1-AA單獨處理組相比，Caspase