β1-腎上腺素受體自身抗體對(duì)大鼠B淋巴細(xì)胞增殖的影響及其可能機(jī)制.pdf

1、研究背景:
　　 心血管疾病是威脅人類健康的常見(jiàn)重大疾病之一，其病死率始終位于我國(guó)居民死因的首位，心血管疾病已成為我國(guó)的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題。盡管現(xiàn)在的診療水平在不斷提高，然而由于心血管疾病的病因繁多，病理機(jī)制復(fù)雜，其病死率、死亡率仍居高不下，提示在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中仍有未知因素參與。隨著神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)的發(fā)展，免疫因素在心血管疾病中的作用日益受到眾多學(xué)者的關(guān)注。1987年Wallukat等人首先在原發(fā)性擴(kuò)張型心肌

2、病患者血清中發(fā)現(xiàn)針對(duì)β1-腎上腺素受體（β1-adrenoceptor，β1-AR）的自身抗體，即β1-腎上腺素受體自身抗體（autoantibodies againstβ1-adrenoceptor，β1-AA）。隨后，很多研究者又在恰加斯心臟病、原發(fā)性心電紊亂等多種心血管疾病患者血清中也檢測(cè)到β1-AA，并且其陽(yáng)性率與滴度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人群。隨后的研究發(fā)現(xiàn)：β1-AA可以與心肌細(xì)胞膜上的β1-AR細(xì)胞外第二環(huán)(the second e

3、xtracellular loop ofβ1-adrenoceptor，β1-AR-ECⅡ，人鼠同源性為100％)結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率增加、增強(qiáng)正常心房肌收縮、增加心肌細(xì)胞內(nèi)的cAMP含量以及增加心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流等，發(fā)揮著類似兒茶酚胺的作用。以上研究結(jié)果提示β1-AA可能參與多種心血管疾病的病理生理過(guò)程。本課題組的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：β1-AA長(zhǎng)期存在于大鼠體內(nèi)時(shí)，在引起心臟結(jié)構(gòu)改變、心功能降低的同時(shí)，還引起機(jī)體

4、的抗體生成能力增加?？贵w是由B淋巴細(xì)胞活化增殖、并經(jīng)過(guò)一系列過(guò)程分化為漿細(xì)胞進(jìn)而分泌的。有研究報(bào)道，外周血中B淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加與心血管疾病的死亡率密切相關(guān)。因此，探討β1-AA是否對(duì)B淋巴細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響將為血清中β1-AA陽(yáng)性的心血管疾病患者的病理機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。
　　 第一部分:β1-AA對(duì)大鼠B淋巴細(xì)胞增殖的影響
　　 目的:
　　 探討β1-AA是否對(duì)培養(yǎng)的大鼠B淋巴細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響。

5、>　　 方法:
　　 1.β1-AA陽(yáng)性血清的制備
　　 用由吉爾生化上海有限公司合成的人β1-AR-ECⅡ(197～223，H-W-W-R-A-E-S-D-E-A-R-R-C-Y-N-D-P-K-C-C-D-F-V-T-N-R-A，人鼠同源性為100％，純度大于95％)主動(dòng)免疫大鼠獲取β1-AA陽(yáng)性IgGs(positive IgGs，pIgGs)，利用偽免疫組獲取β1-AA陰性IgGs(negative IgGs，

6、nIgGs)作為對(duì)照。利用Mab Trap Kit試劑盒純化血清中的總IgGs。純化后的IgGs先經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)其純度，然后使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)總IgGs進(jìn)行蛋白定量。
　　 2.B淋巴細(xì)胞的獲得
　　 用Ficoll密度梯度離心法分離大鼠脾臟中的淋巴細(xì)胞并用免疫磁珠分選(MagneticActivated Cell Sorting，MACS)技術(shù)獲得B淋巴細(xì)胞；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性率與

7、活力；用RPMI1640完全培養(yǎng)液將B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5％CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。
　　 3.CCK8試劑盒檢測(cè)β1-AA對(duì)B淋巴細(xì)胞增殖的影響
　　 將pIgGs與nIgGs分別作用于靜息B淋巴細(xì)胞和LPS刺激的B淋巴細(xì)胞，采用CCK8檢測(cè)試劑盒檢測(cè)β1-AA對(duì)B淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.利用β1-AR-ECⅡ抗原肽段主動(dòng)免疫大鼠獲取β1-AA
　　 1.1主動(dòng)

8、免疫模型建立成功
　　 β1-AR-ECⅡ抗原肽段初次免疫大鼠2周后，血清中β1-AA的A值已由0.41±0.06升高到0.75±0.11（P=0.006，P＜0.01）。并且，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，β1-AA水平迅速升高并且8周時(shí)達(dá)高峰，A值達(dá)到3.01±0.020，且明顯高于同期偽免疫組(A值為0.42±0.10，P=0.000，P＜0.01)。以上結(jié)果提示：β1-AR-ECⅡ抗原肽段主動(dòng)免疫大鼠模型建立成功，且免疫8周后進(jìn)行大鼠

9、腹主動(dòng)脈采血并留取血清（圖1）。
　　 1.2β1-AA蛋白定性及定量測(cè)定
　　 用親和柱試劑盒純化血清中的總IgGs。用SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)純化的IgGs的純度。結(jié)果顯示，純化的IgGs在SDS-PAGE凝膠電泳后出現(xiàn)兩條帶，一條表示IgG重鏈(55KD)，另一條表示輕鏈(25KD)，這兩條帶與IgG標(biāo)準(zhǔn)品相一致（圖2），提示純化效果理想。利用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定純化的IgGs濃度（圖3及表1）。
　

10、　 2.成功分離大鼠B淋巴細(xì)胞
　　 2.1 MACS后大鼠B淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性率
　　 用Ficoll密度梯度離心法分離大鼠脾臟淋巴細(xì)胞經(jīng)MACS分選后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性率為92.7％（圖4）。該結(jié)果提示大鼠B淋巴細(xì)胞分選成功。
　　 2.2 MACS后大鼠B淋巴細(xì)胞的活性測(cè)定
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)MACS分選后大鼠B淋巴細(xì)胞的活細(xì)胞率為94.6％（圖5）。
　　 3.β1-AA對(duì)

11、靜息的B淋巴細(xì)胞的數(shù)量無(wú)影響
　　 0.1μM pIgGs作用靜息大鼠B淋巴細(xì)胞24小時(shí)后，A值變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(A值：0.320±0.012 vs.0.309±0.011，t=0.060，P=0.524，P＞0.05，圖6)。該結(jié)果提示β1-AA可能對(duì)靜息B淋巴細(xì)胞的數(shù)量無(wú)改變。
　　 4.β1-AA促進(jìn)LPS激活的B淋巴細(xì)胞增殖
　　 0.1μM pIgGs促進(jìn)了LPS刺激的大鼠B淋巴細(xì)胞增殖（A值:0.73

12、9±0.036 vs.0.533±0.032，P＜0.05），0.1μMβ1-AA陰性的IgGs(β1-AA negative IgGs，nIgGs)卻無(wú)此作用(A值：0.552±0.044 vs.0.533±0.032，P=0.350，P＞0.05，圖7)。
　　 當(dāng)用β1-AR-ECⅡ?qū)ⅵ?-AA中和以后，與nIgGs相比，β1-AA的促增殖效應(yīng)消失(A值：0.552±0.044 vs.0.560±0.048，P=0.238

13、，P＞0.05，圖7)；β1-AR-ECⅡ本身對(duì)活化B淋巴細(xì)胞的增殖無(wú)影響（A值：0.575±0.052 vs.0.533±0.032，P=0.078，P＞0.05，圖7）。
　　 以上結(jié)果提示，促進(jìn)LPS激活的B淋巴細(xì)胞增殖是由β1-AA引起的。
　　 5.β1-AA對(duì)LPS刺激的B淋巴細(xì)胞的增殖作用具有濃度依賴趨勢(shì)
　　 不同濃度β1-AA(0.001μM，0.01μM，0.1μM，1μMpIgGs)干預(yù)LP

14、S預(yù)刺激48小時(shí)的B淋巴細(xì)胞24小時(shí)后，與nIgGs組相比，A值分別由0.536±0.040、0.542±0.036、0.538±0.030、0.561±0.051增加到0.612±0.029、0.654±0.047、0.739±0.036、0.768±0.030，提示β1-AA對(duì)LPS刺激的大鼠B淋巴細(xì)胞的促增殖作用有濃度依賴的趨勢(shì)（圖8）。
　　 小結(jié):
　　 β1-AA可以促進(jìn)LPS激活的大鼠B淋巴細(xì)胞增殖，并且該

15、增殖效應(yīng)具有濃度依賴的趨勢(shì)；β1-AA對(duì)靜息B淋巴細(xì)胞的數(shù)量無(wú)改變。
　　 第二部分:β1-AA致B淋巴細(xì)胞增殖的可能機(jī)制
　　 目的:
　　 探討β1-AA致培養(yǎng)的大鼠B淋巴細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.B淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞的獲得
　　 用Ficoll密度梯度離心法分離大鼠脾臟中的淋巴細(xì)胞并用免疫磁珠分選(MACS)技術(shù)獲得B淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞；流式細(xì)

16、胞術(shù)檢測(cè)MACS分選獲得的這兩種細(xì)胞的陽(yáng)性率；利用Guava流式儀檢測(cè)細(xì)胞的活力；培養(yǎng)方法同第一部分。
　　 2.B淋巴細(xì)胞中β1-AR的檢測(cè)
　　 用Real Time PCR技術(shù)檢測(cè)B淋巴細(xì)胞中是否有β1-AR的基因表達(dá)；用免疫熒光方法檢測(cè)B淋巴細(xì)胞膜表面是否有β1-AR的蛋白表達(dá)。
　　 3.CCK8試劑盒檢測(cè)B淋巴細(xì)胞增殖能力
　　 β1-AR阻斷劑Metoprolol、β2-AR阻斷劑ICI11

17、8551、β1/β2-AR阻斷劑Nadolol預(yù)孵育后利用CCK8法探討β1-AA致B淋巴細(xì)胞增殖是否通過(guò)β-AR受體途徑起作用；β1-AA作用72小時(shí)的、ConA刺激的CD4+T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)上清液作用于靜息B淋巴細(xì)胞24小時(shí)后，利用CCK8法探討β1-AA是否通過(guò)作用于CD4+T淋巴細(xì)胞間接影響B(tài)淋巴細(xì)胞的數(shù)量。
　　 結(jié)果:
　　 1.B淋巴細(xì)胞膜表面存在β1-AR
　　 1.1 B淋巴細(xì)胞中有β1-AR的

18、基因表達(dá)
　　 利用公司合成的β1-AR、β2-AR通過(guò)Real Time-PCR檢測(cè)到B淋巴細(xì)胞中有β1-AR與β2-AR基因表達(dá)（圖9）。
　　 1.2 B淋巴細(xì)胞膜表面有β1-AR的蛋白表達(dá)
　　 利用免疫熒光法檢測(cè)到B淋巴細(xì)胞膜表面存在β1-AR的蛋白表達(dá)（圖10）。
　　 2.β1/β2-AR共同參與介導(dǎo)β1-AA致激活B淋巴細(xì)胞增殖作用
　　 2.1β1-AR參與介導(dǎo)β1-AA致激活B

19、淋巴細(xì)胞增殖作用
　　 0.01μMβ1-腎上腺素受體(β1-AR)阻斷劑Metoprolol預(yù)作用，可以部分阻斷pIgGs的致激活B淋巴細(xì)胞的增殖作用（0.739±0.036 vs.0.672±0.028，P=0.008，P＜0.01，圖11），但仍高于PBS溶劑對(duì)照組的0.533±0.032（P=0.000，P＜0.01，圖11）；，Metoprolol本身無(wú)作用（0.533±0.032 vs.0.523±0.036，P=0

20、.695，P＞0.05，圖12）。該結(jié)果提示：β1-AA可能部分通過(guò)B淋巴細(xì)胞膜表面的β1-AR引起活化的B淋巴細(xì)胞增殖。
　　 2.2β2-AR參與介導(dǎo)β1-AA致激活B淋巴細(xì)胞增殖作用
　　 0.01μMβ2-腎上腺素受體（β2-AR）阻斷劑ICI118551的預(yù)作用，使得A值由原來(lái)的0.739±0.036降低至0.638±0.033（P＜0.01），但仍高于PBS溶劑對(duì)照組的0.533±0.032(P=0.000，

21、P＜0.01)；ICI118551本身無(wú)作用（0.533±0.032 vs.0.511±0.031，P=0.390，P＞0.05，圖12）。該結(jié)果提示：β1-AA可能部分通過(guò)B淋巴細(xì)胞膜表面的β2-AR引起活化的B淋巴細(xì)胞增殖。
　　 2.3β1/β2-AR共同介導(dǎo)β1-AA的致激活B淋巴細(xì)胞增殖作用
　　 β1/β2-AR兩種受體的非特異性阻斷劑Nadolol的預(yù)作用使β1-AA對(duì)活化B淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)消失(A值：0

22、.528±0.062 vs.0.533±0.032，P＞0.05)；Nadolol本身無(wú)作用（0.533±0.032vs.0.528±0.061，P=0.855，P＞0.05，圖12）。該結(jié)果提示：β1-AA對(duì)LPS刺激的B淋巴細(xì)胞的促增殖作用可能是通過(guò)β1-AR和β2-AR信號(hào)通路共同介導(dǎo)的。
　　 3.β1-AA可能通過(guò)激活的CD4+T淋巴細(xì)胞間接促進(jìn)靜息B淋巴細(xì)胞增殖
　　 3.1大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞的獲得及活性

23、測(cè)定
　　 用密度梯度離心法分離大鼠脾臟淋巴細(xì)胞經(jīng)免疫磁珠分選后，CD4+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率為92.7％(圖13)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選后的大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞的活細(xì)胞率＞90％。
　　 3.2β1-AA激活的CD4+T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液促進(jìn)了靜息B淋巴細(xì)胞增殖
　　 PBS、0.1OμM pIgGs、0.1μM nIgGs分別作用于刀豆蛋白A(ConA)刺激的CD4+T淋巴細(xì)胞，72小時(shí)后取出三種培養(yǎng)上清液，并分

24、別作用于靜息B淋巴細(xì)胞24小時(shí)后，使得反應(yīng)增殖效應(yīng)的A值分別為0.460±0.033、0.480±0.054、0.552±0.055（F=6.061，P=0.012，P＜0.05）。與PBS組相比，陰性IgGs組沒(méi)有促進(jìn)靜息B淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)（0.480±0.054vs.0.460±0.033，P=0.483，P＞0.05）。與nIgGs組相比，pIgGs組促進(jìn)了靜息B淋巴細(xì)胞的增殖作用（0.55±0.055 vs.0.480±0.0

25、54，P=0.02，P＜0.05）（圖14）。該結(jié)果提示，β1-AA可以通過(guò)作用于CD4+T淋巴細(xì)胞間接引起靜息B淋巴細(xì)胞增殖。
　　 小結(jié):
　　 β1-AA可能通過(guò)B淋巴細(xì)胞表面的β1/β2-AR引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞增殖；也可能通過(guò)作用于CD4+T淋巴細(xì)胞問(wèn)接導(dǎo)致靜息B淋巴細(xì)胞增殖。
　　 結(jié)論:
　　 β1-AA既可能通過(guò)B淋巴細(xì)胞表面的β1-AR/β2-AR致活化B淋巴細(xì)胞增殖，也可能通過(guò)作用于活化的C