去甲腎上腺素和α1腎上腺素受體亞型選擇性拮抗藥誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞活化、增殖、分泌功能的作用及機(jī)制研究.pdf

1、各種致病因素包括慢性病毒性肝炎、酗酒、藥物相互作用、代謝紊亂等所致的慢性肝損傷均可引起肝纖維化,它的病理特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度沉積。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是一種位于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞之間的非實質(zhì)性細(xì)胞。它的激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié),誘導(dǎo)活化的HSC凋亡可使肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。
　　國內(nèi)外的一些研究顯示,交感神經(jīng)系統(tǒng)(sympathe

2、tic nervous system,SNS)參與控制和調(diào)整生物的活動,它可以保持器官和內(nèi)外部環(huán)境的相對平衡,SNS也參與肝臟功能的調(diào)控。去甲腎上腺素(noradrenaline,NA)作為交感神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì),可能發(fā)揮重要作用。這為進(jìn)一步理解肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了堅實的理論基礎(chǔ)。
　　研究表明,肝臟和HSC中表達(dá)多種腎上腺素受體亞型,但具體表達(dá)何種亞型還不能確定,存在一定爭議,需要進(jìn)一步研究。也有實驗表明,NA對HS

3、C有促進(jìn)增值和抑制凋亡的作用。本課題組前期實驗已在整體水平上證實,NA有促進(jìn)HSC增殖的作用,非選擇性α-AR拮抗藥酚妥拉明(phentolamine,PTL)能夠抑制HSC增殖。本實驗在此基礎(chǔ)上,希望能夠篩選出高表達(dá)的腎上腺素受體亞型,觀察NA對HSC的作用,以及NA是否通過特異性受體發(fā)揮作用,找到藥物特異性的作用靶點,增加藥效,降低副作用,并進(jìn)一步對NA影響HSC的機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　目的:
　　探討α1腎上腺素受體

4、(α1-adrenoceptor subtypes,α1-AR)亞型在大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)中的表達(dá)情況,來明確在HSC-T6中優(yōu)勢表達(dá)的腎上腺素受體亞型。并探討交感神經(jīng)遞質(zhì)NA和α1B-,α1D-AR亞型拮抗藥對HSC-T6激活、增殖和ECM分泌的影響,進(jìn)一步探討NA對HSC-T6作用的信號通路,來明確NA影響HSC-T6的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)HSC-T6,分為以下13組:(1)對照組,為HS

5、C-T6組;(2) NA(10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L)組;(3)α1B-AR拮抗藥氯乙基可樂定(Chloroethylclonidine Dihydrochloride,CEC10-5 mol/L)組;(4)α1D-AR拮抗藥BMY7378(10-5 mol/L)組;(5)Gα抑制劑百日咳毒素(pertussis toxin,PT10-5 mol/L)組;(6)蛋白激酶C(protein ki

6、nase C,PKC)抑制劑RO-32-0432(10-5 mol/L)組;(7)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑LY294002(10-5 mol/L)組;(8)AKT抑制劑GSK690693(10-5 mol/L)組。
　　2.細(xì)胞免疫組化法和反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法測定α1A-,α1B-,α1D-AR在HSC

7、-T6中的表達(dá)位置及表達(dá)量。
　　3.四甲基偶氮唑鹽比色(MTT)法測定細(xì)胞增殖情況,并通過線性回歸求得 NA的半數(shù)有效濃度(EC50)。
　　4.蛋白免疫印跡法(western blot)、RT-PCR法測定加入激動藥、拮抗藥和信號分子抑制劑后,HSC-T6的活化指標(biāo):轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達(dá)情況;ECM分泌指標(biāo):金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)、I型膠原(ColΙ

8、)的表達(dá)情況。
　　5.Western blot、RT-PCR法測定PKC-PI3K-AKT信號通路中信號分子PKC、PI3K的表達(dá)和AKT的磷酸化。
　　結(jié)果:
　　1.HSC-T6表達(dá)α1-AR的情況
　　α1-AR多表達(dá)于HSC-T6細(xì)胞膜上,且α1B-,α1D-AR表達(dá)較多,α1A-AR未檢測到表達(dá)。
　　2.NA及特異性受體亞型拮抗藥對HSC-T6增殖的影響
　　NA濃度依賴性促 HSC-T

9、6增殖,EC50為277nmol/L,加入α1B-AR、α1D-AR拮抗藥,細(xì)胞增殖均受到明顯抑制,且α1B-AR對NA促HSC-T6增殖的抑制作用為非競爭性拮抗,α1D-AR的作用為競爭性拮抗。
　　3.NA、α1腎上腺素受體亞型拮抗藥和多種信號通路信號分子抑制劑對 HSC-T6激活和ECM分泌的影響NA促進(jìn)HSC-T6的TGF-β1、α-SMA、TIMP-1和ColΙ表達(dá);加入α1B-AR、α1D-AR拮抗藥及Gα蛋白偶聯(lián)的P

10、KC-PI3K-AKT信號通路各信號分子抑制劑后,可顯著下調(diào)它們的的表達(dá)。
　　4.NA和α1腎上腺素受體亞型拮抗藥對 PKC-PI3K-AKT信號通路中信號分子表達(dá)的影響
　　NA促進(jìn)PKC-PI3K-AKT信號通路中信號分子PKC、PI3K的表達(dá)和AKT的磷酸化,加入α1B-AR、α1D-AR拮抗藥可顯著抑制PKC、PI3K的表達(dá),降低AKT的磷酸化。
　　結(jié)論:
　　1.HSC-T6表達(dá)α1B-AR和α1D

11、-AR兩種α1-AR亞型,表達(dá)部位在細(xì)胞膜,表達(dá)水平α1B-AR多于α1D-AR。
　　2.交感神經(jīng)遞質(zhì)NA通過作用于α1B-AR、α1D-AR促進(jìn)HSC-T6激活、增殖和ECM分泌,并且呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　3.NA促進(jìn)HSC-T6增殖的作用具有濃度依賴性,其EC50為277nmol/L,α1D-AR拮抗藥對NA促HSC-T6增殖的抑制作用為競爭性拮抗,α1B-AR拮抗藥的作用為非競爭性拮抗。
　　4.NA激活Gα蛋