抗β1-腎上腺素受體自身抗體對T淋巴細胞增殖和分泌功能的影響.pdf

1、研究背景神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)是機體重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，三者之間相互協(xié)調(diào)、相互平衡，從而維持機體功能的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)這種平衡被各種理化因素破壞時，會導(dǎo)致病理過程的出現(xiàn)和/或某些疾病的發(fā)生。
　　 交感神經(jīng)系統(tǒng)是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，在維持機體功能穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。在生理情況下，交感神經(jīng)激活后，其末梢釋放的兒茶酚胺類物質(zhì)，通過與分布在靶器官上的腎上腺素受體結(jié)合，來調(diào)節(jié)各種靶器官的功能活動。有大量研究發(fā)現(xiàn)兒茶酚

2、胺類物質(zhì)的異常釋放與很多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而，在某些病理情況下，機體表現(xiàn)出交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活的現(xiàn)象并不能完全用兒茶酚胺類物質(zhì)大量釋放來解釋，提示可能還有其他未知因素的參與。
　　 上世紀(jì)九十年代以來，諸多研究人員在擴張型心肌病、原發(fā)性電紊亂以及chagas 病等多種心血管疾病患者血清中發(fā)現(xiàn)有類兒茶酚胺的物質(zhì)，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，這種物質(zhì)是針對β1-AR細胞外第二環(huán)（the second extracellular loo

3、p of β1-adrenoceptor，β1-AR-ECII）的自身抗體，即β1-AA（Autoantibodies against the second extracellular loop of β1-adrenoceptor)，它可以與β1-AR-ECII 結(jié)合發(fā)揮類激動劑樣的作用，提示β1-AA 可能與交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活有關(guān)。
　　 以往人們對β1-AA的研究只局限于其對心血管系統(tǒng)的影響，隨著神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)

4、的發(fā)展，這種自身抗體對機體的影響有待重新審視。已有研究發(fā)現(xiàn)，β-AR的激動劑異丙腎上腺素（ISO）可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能。我們的前期研究用主動免疫的方法誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生β1-AA，即用人β1-AR-ECII （人鼠同源性為100％）主動免疫Wistar大鼠18個月后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生明顯障礙的同時，反映大鼠T淋巴細胞活性狀態(tài)的外周血CD4+/CD8+淋巴細胞比值也升高，提示β1-AA的長期存在可能會導(dǎo)致機體的免疫功能發(fā)生改

5、變。但是，主動免疫過程是將抗原肽段注入大鼠體內(nèi)，在此過程中抗原肽段本身可能會導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)功能發(fā)生改變，因此該研究還不能得出β1-AA 長期存在可以直接導(dǎo)致免疫系統(tǒng)發(fā)生改變的結(jié)論；另外，由于在此過程中，動物體內(nèi)產(chǎn)生的β1-AA 遠高于臨床患者血清中該抗體的水平，因而用主動免疫模型的研究結(jié)果來解釋臨床也并不合理。因此，我們需要建立血清中β1-AA濃度接近臨床實際情況的動物模型，進一步觀察β1-AA 長期存在對機體免疫系統(tǒng)功能的影響。

6、r>　　 眾所周知T淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)中功能最重要的一類細胞群，而T淋巴細胞的增殖是其發(fā)揮多種生物學(xué)功能的前提。已有研究報道， 兒茶酚胺類物質(zhì)可以通過β1-AR-cAMP-PKA、β2-AR-cAMP-PKA、β1/β2-AR-PKC以及Ca2+途徑來調(diào)節(jié)靶細胞的功能活動。而在大鼠的T淋巴細胞表面存在的β-AR亞型主要是β2-AR，其表面幾乎不存在β1-AR，那么，該自身抗體對大鼠T淋巴細胞的增殖是否有影響？如果有，是通過何種途徑

7、來實現(xiàn)的？Ca2+又在其中扮演何種角色？
　　 決定T淋巴細胞功能特征的關(guān)鍵因素是它們所分泌的細胞因子種類。其中IL-2和IFN-γ是由Th1細胞合成和分泌的，反映機體細胞免疫功能；而IL-4是由Th2合成和分泌，介導(dǎo)體液免疫。因此我們在本研究中檢測這些細胞因子的分泌水平來反映機體的免疫功能狀態(tài)。目前研究報道，在人的T淋巴細胞上可同時表達有β1-AR、β2-AR 以及β3-AR。鑒于在大鼠的T淋巴細胞表面幾乎不表達β1-AR，所

8、以我們不能完全用以上動物實驗結(jié)果來反映β1-AA對臨床患者免疫系統(tǒng)的影響。因此，我們選用人外周血T淋巴細胞，觀察β1-AA對人外周血T淋巴細胞增殖和分泌的影響？并進一步分析其途徑。
　　 綜上所述，本課題的研究目的（1）建立與臨床患者血清中β1-AA 滴度相匹配的β1-AA被動免疫大鼠模型，觀察β1-AA 長期存在對機體免疫功能是否有影響？（2）以免疫磁珠分選的大鼠脾臟T淋巴細胞為研究對象，研究β1-AA對大鼠T淋巴細胞增殖和分

9、泌功能的影響？（3）以免疫磁珠分選的人外周血T淋巴細胞為研究對象，研究β1-AA對人T淋巴細胞的增殖和分泌功能的影響，同時探索其作用途徑如何？
　　
　　 第一部分β1-AA 長期存可以導(dǎo)致大鼠免疫系統(tǒng)功能改變
　　 研究目的：建立與臨床患者血清中β1-AA水平相匹配的β1-AA 被動免疫大鼠模型，觀察β1-AA長期存在對機體免疫功能的影響。
　　 材料和方法：1.實驗動物健康雄性Wistar大鼠，8周齡

10、，體重180-200g。2.實驗方法2.1抗原肽段的合成根據(jù)人β1腎上腺素受體細胞外第二環(huán)的氨基酸序列（β1-AR-ECII）（197aa-223aa，H-W-W-R-A-E-S-D-E-A-R-R-C-Y-N-D-P-K-C-C-D-F-V-T-N-R-A），由吉爾生化上海有限公司合成抗原肽段，純度>95％。2.2 獲取β1-AA選用健康的8周齡雄性Wistar大鼠作為免疫對象，隨機分為兩組：① β1-AR-ECII 肽段組即免疫組（

11、n=40）：將抗原和免疫佐劑的混合物按0.4μg/g 劑量注入動物背部皮下，每兩周加強免疫一次，共免疫8周。②溶劑對照組即偽免疫組（n=40）：將生理鹽水和免疫佐劑的混合物以一定比例注入動物背部皮內(nèi)，每兩周加強免疫一次，共免疫8周。用SA-ELISA (Streptavidin-enzyme linked immunosorbent assay)方法檢測血清中β1-AA的水平。利用Mab Trap Kit 試劑盒對免疫組陽性血清中的β1

12、-AA及偽免疫組陰性血清中的IgG 進行提取和純化。純化后的抗體蛋白經(jīng)SDS-PAGE 膠凝膠電泳檢測其純度，使用BCA 試劑盒進行蛋白定量。2.3大鼠被動免疫β1-AA組：將提純后的β1-AA IgGs 按2μg/g 體重劑量經(jīng)鼠尾靜脈注入大鼠體內(nèi)，每2周加強免疫一次，共免疫20周；偽免疫組：將從β1-AA 陰性的血清中提純的IgGs 注射到大鼠體內(nèi)，免疫方法和劑量同前一組。2.4大鼠在體心功能檢測建立被動免疫模型后，定期（0w、4w

13、、8w、12w、16w、20w）監(jiān)測大鼠的心功能。每組隨機抽取5只大鼠，氨基甲酸乙酯（20％，1g/kg）腹腔麻醉后，經(jīng)右頸總動脈小心插向左心室，以出現(xiàn)特征性左心室壓力波為插入標(biāo)志后，固定導(dǎo)管，打開動脈夾。用BL-410生物信號記錄分析系統(tǒng)檢測并記錄各心功能參數(shù)：左心室收縮壓（Left Ventricular SystolicPressure，LVSP）、左心室舒張末期壓（Left Ventricular End-Diastolic P

14、ressure，LVEDP）、左心室壓力上升的最大速率（+dp/dtmax）和左心室壓力下降的最大速率（-dp/dtmax）。2.5大鼠脾臟淋巴細胞分離大鼠麻醉，無菌取出大鼠脾臟；用注射器內(nèi)芯研磨脾臟，過200目篩網(wǎng)，獲取單細胞懸液；低滲破壞紅細胞后，獲取脾臟淋巴細胞。2.6 流式細胞術(shù)檢測大鼠外周血CD4+/CD8+T淋巴細胞比值測定取100μL 外周血（1×106個/mL），按試劑說明書分別加入FITC 標(biāo)記的CD4抗體與PE標(biāo)記的

15、CD8抗體，同時另設(shè)管標(biāo)記FITC 或PE 熒光標(biāo)記的單克隆大鼠IgG1抗體作為陰性對照，避光室溫作用20min；用PBS溶液，洗細胞3次；200μL PBS溶液重懸細胞，上流式細胞儀獲取10,000個細胞，先以陰性對照測出本底參數(shù)，再進行樣本測定，計算機讀出測定值。以T淋巴細胞CD4+/CD8+值評估機體免疫狀態(tài)。2.7 被動免疫大鼠B 淋巴細胞抗體生成能力測定用20％綿羊紅細胞(SRBC)生理鹽水懸液腹腔免疫大鼠，4天后無菌取出脾臟

16、，用PBS洗一次后置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用無菌注射器針芯研磨成懸液，PBS 洗滌兩次，用RPMI1640調(diào)整細胞數(shù)為5×106/mL。按照Jerne和Nordin等改良的直接及間接溶血空斑實驗測定B 淋巴細胞抗體生成能力?？瞻邤?shù)量采用VilBer Lourmat capt 軟件測定。2.8大鼠心臟、肝臟、腎臟組織石蠟切片的HE 染色將石蠟切片用二甲苯脫蠟；經(jīng)各級乙醇梯度脫水后蒸餾水洗；蘇木素染色5min，伊紅染色2min；常規(guī)脫水，透明

17、，封片，光鏡下觀察心臟、肝臟、腎臟的組織病理切片。
　　 結(jié)果：1通過主動免疫大鼠成功獲取β1-AA1.1主動免疫大鼠模型建立成功大鼠在第一次免疫后2周，與偽免疫組相比，β1-AR-ECII 肽段免疫組血清中β1-AA的OD值已由0.73±0.06 升高到0.41±0.05（P<0.05）；到8周時免疫組血清中的β1-AA的OD值達到3.02±0.09，遠高于偽免疫組0.40±0.02（P<0.01），（圖1-1）。本結(jié)果提示主

18、動免疫模型建立成功。1.2 β1-AA蛋白定性及定量測定結(jié)果用親和柱純化β1-AA，純化后的β1-AA 經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳檢測純度，結(jié)果有兩條帶出現(xiàn)（圖1-2），分別是IgG 重鏈（55KD）和輕鏈（25KD），此條帶與IgG 標(biāo)準(zhǔn)品相一致，表明純化效果理想。純化后的β1-AA 經(jīng)BCA 試劑盒測定：蛋白濃度為8mg/mL。2 β1-AA 被動免疫大鼠模型建立成功2.1被動免疫過程中大鼠體內(nèi)β1-AA水平維持在一定水平在被動免

19、疫前，大鼠血清中β1-AA的OD值為0.08±0.030，到被動免疫第4周時，血清中β1-AA的OD值達到0.22±0.029，明顯高于偽免疫組的OD值0.09±0.040（P<0.001）。隨著被動免疫時間的延長，免疫組大鼠血清中的β1-AA水平可以維持在一定水平，并且與偽免疫組相比，都有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.001，圖1-3）。2.2 β1-AA 被動免疫大鼠在體心功能的變化在被動免疫后8周，與偽免疫組相比，免疫組大鼠的左室收縮壓

20、（LVSP）和室內(nèi)壓上升的最大速率（+dp/dtmax）（反映左室收縮功能的指標(biāo)）明顯升高，而反映左室舒張功能的指標(biāo)左室舒張末壓（LVEDP）和室內(nèi)壓下降的最大速率（-dp/dtmax）沒有明顯變化（P>0.05）。到被動免疫第20周時，與偽免疫組相比，免疫組大鼠的LVSP 明顯下降、+dp/dtmax 明顯下降、LVEDP 明顯升高、-dp/dtmax 明顯下降。（圖1-4A，B，C，D）提示：隨著被動免疫時間的延長，免疫組大鼠心功能

21、出現(xiàn)了明顯下降。3 β1-AA 長期存在導(dǎo)致大鼠機體免疫功能發(fā)生改變3.1β1-AA 長期存在可以導(dǎo)致大鼠外周血CD4+/CD8+T淋巴細胞比值增加在被動免疫4周時，β1-AA免疫組的CD4+/CD8+T細胞比值開始升高，但與偽免疫組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；到免疫第8周時，β1-AA免疫組的CD4+/CD8+比值由偽免疫組的2.00±0.45 升高到免疫組2.92±0.39（P<0.05），并且在被動免疫8周以后，這種增高趨勢

22、仍然持續(xù)，到被動免疫20周時，免疫組CD4+/CD8+比值升高到3.49±0.42，遠高于偽免疫組1.89±0.40（P<0.01）（圖1-5）。結(jié)果提示，β1-AA在體內(nèi)長期存在，可以導(dǎo)致機體的細胞免疫功能發(fā)生改變。3.2 β1-AA 長期存在可以使大鼠B 淋巴細胞抗體生成能力增強本研究采用直接及間接溶血空斑實驗來測定β1-AA 長期存在大鼠B 淋巴細胞的功能（即抗體生成能力）來反映機體的體液免疫功能。結(jié)果顯示，在免疫第8周時，β1-

23、AA 被動免疫組大鼠直接溶血空斑數(shù)量和間接溶血空斑數(shù)量分別達到960±89，1527±84，與偽免疫組相比（810±67，1321±78），均有明顯增多（P<0.05），并且在8周后溶血空斑數(shù)量呈持續(xù)增高趨勢，到20周時這種差異更為明顯（P<0.01）（圖1-6A， B）。以上結(jié)果提示，在β1-AA 長期存在于體內(nèi)，大鼠出現(xiàn)免疫系統(tǒng)抗體生成能力增強，即體液免疫功能增強。3.3 β1-AA 長期存在可以導(dǎo)致大鼠心臟、肝臟、腎臟淋巴細胞浸潤

24、被動免疫20周時，大鼠心臟進行HE 染色發(fā)現(xiàn)：在β1-AA免疫組心肌細胞排列紊亂，并且在間質(zhì)有淋巴細胞浸潤；而偽免疫組心肌組織形態(tài)與間質(zhì)均未見異常（圖1-7）；在免疫20周時，大鼠肝臟HE 染色顯示：在肝竇周圍有大量淋巴細胞浸潤（圖1-8），對照組未發(fā)生明顯改變；同時，免疫組大鼠腎臟的腎小球和腎小管周圍也有大量淋巴細胞浸潤（圖1-9），而偽免疫組未見明顯改變。
　　 小結(jié)一：1. 用純化的β1-AA 長期被動免疫可建立與臨床病人

25、抗體水平匹配的動物模型。2. Β1-AA 長期存在可引發(fā)機體的細胞免疫功能改變。3. Β1-AA 長期存在可以使B 淋巴細胞抗體生成能力增強。
　　
　　 第二部分β1-AA主要通過β2-AR途徑促進ConA激活的大鼠T淋巴細胞增殖和分泌功能
　　 研究目的：1. 以免疫磁珠分選的大鼠脾臟T淋巴細胞為研究對象，研究β1-AA對大鼠T淋巴細胞增殖和分泌功能的影響。2.觀察鈣離子在β1-AA 促進大鼠T淋巴細胞增殖中

26、的作用。
　　 材料與方法：1. 實驗對象健康雄性Wistar大鼠。2. 實驗方法2.1大鼠脾臟CD3+T淋巴細胞分離無菌取出大鼠脾臟；用注射器內(nèi)芯研磨脾臟，過200目篩網(wǎng)，獲取單細胞懸液；低滲溶液破壞紅細胞后，獲取脾臟淋巴細胞；用免疫磁珠分選CD3+的T淋巴細胞。采用流式細胞技術(shù)檢測分選的大鼠CD3+T淋巴細胞的陽性率；采用Guava PCA CytoSoft6.0.2 軟件的ViaCount 模塊進行細胞活性測定。2.2 利

27、用免疫熒光化學(xué)方法觀察β1-AR在大鼠T淋巴細胞上的表達將純化分離的大鼠T淋巴細胞進行涂片，用4％的多聚甲醛室溫固定20min后，PBS漂洗三次，用含10％胎牛血清的PBS 室溫封閉2h；加入特異性一抗4℃孵育過夜；PBS漂洗3次，加入二抗37℃避光孵育半小時；去除二抗，加入DAPI 染色液室溫作用15min以上，PBS 沖洗三次，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。2.3 實驗分組2.3.1觀察β1-AA對分選的淋巴細胞的增殖的影響，分為以

28、下2組：（1）溶劑對照組：分選的淋巴細胞加入生理鹽水；（2）β1-AA 處理組：分選的淋巴細胞直接加入β1-AA。2.3.2 根據(jù)T淋巴細胞的活化特性，分為以下2組（1）溶劑組對照：分選的T淋巴細胞加入生理鹽水；（2）ConA 處理組：給予分選的T淋巴細胞5μg/mL ConA 預(yù)刺激72h。將激活的T淋巴細胞懸液均勻接種于96孔細胞培養(yǎng)板（100μL/孔），每孔分別加入20μL 各種干預(yù)因素：2.3.3為了觀察β1-AA對ConA 激

29、活的T淋巴細胞是否有促增殖作用分為以下5組（1）溶劑對照組：生理鹽水；（2）陰性對照：β1-AA 陰性血清IgGs組（0.1μmol/L）；（3） 陽性對照組：不同濃度的β-AR 激動劑異丙腎上腺素組（ISO，0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L）；（4）不同濃度的β1-AA組（0.01μmol/L，0.1μmol/L，1μmol/L）；（5） β1-AA（0.1μmol/l）＋β1-AR抗原肽段組（3μmol/L）

30、；2.3.4為了觀察不同干預(yù)對β1-AA對ConA 激活的T淋巴細胞增殖的影響分為以下10組（1）β1-AA（0.1μmol/l）+β1-AR 阻斷劑Atenolol組（1μmol/l）；（2）β1-AA（0.1μmol/l）+β2-AR 阻斷劑ICI118,551組（1μmol/L）；（3）β1-AA（0.1μmol/l）+β1/β2-AR 阻斷劑Nadolol組（1μmol/L）；（4）β1-AA（0.1μmol/l）+β-AR 阻

31、斷劑Propranolol組（1μmol/L）；（5）β1-AA（0.1μmol/l）+PKA 抑制劑H-89（1μmol/L）；（6）β1-AA（0.1μmol/l）+PKC 抑制劑Chelerythrine Chloride（1μmol/L）；（7） β1-AA（0.1μmol/l）+PKA 抑制劑H-89（1μmol/L）+PKC 抑制劑ChelerythrineChloride（1μmol/L）；（8）β1-AA（0.1μmol

32、/l）＋L-Ca通道阻斷劑維拉帕米（1μmol/l）（9）β1-AA（0.1μmol/l）＋IP3 受體阻斷劑肝素（1μmol/l）（10）β1-AA（0.1μmol/l）＋鈣釋放活化的Ca2+通道（CRCA）阻斷劑SKF96365（1μmol/l）2.3.5為了觀察單獨的阻斷劑對T淋巴細胞增殖的影響分為以下6組（1）β1-AR 阻斷劑Atenolol組（1μmol/l）；（2）β2-AR 阻斷劑ICI118,551組（1μmol/L）

33、；（3）β1/β2-AR 阻斷劑Nadolol組（1μmol/L）；（4）β-AR 阻斷劑Bupranolol組（1μmol/L）；（5）PKA 抑制劑H-89（1μmol/L）；（6）PKC 抑制劑Chelerythrine（1μmol/L）；2.4 用CCK-8 法檢測大鼠T淋巴細胞增殖將上述加入各種干預(yù)的T淋巴細胞置5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)48h，之后每孔加入10μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，由于生成的甲臜物的數(shù)

34、量與活細胞的數(shù)量成正比，在酶標(biāo)儀上于波長λ=450nm 處讀取各孔的OD值，進行細胞增殖分析，以上各組重復(fù)8次。2.5 ELISA 法測定T淋巴細胞cAMP水平以及細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ及IL-4 含量將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品100μL 加入酶標(biāo)板中，置37℃孵育60～90min；用洗板液充分洗板4次；每孔加酶標(biāo)抗體工作液，置37℃孵育60～90min；用洗板液充分洗板4次；每孔加底物工作液，置37℃避光反應(yīng)15min；用洗板液充分洗

35、板4次；每孔加終止液，混勻后即刻于酶標(biāo)儀450nm 波長處測量OD值。2.6 T淋巴細胞胞漿中鈣離子水平的測定采用前述方法分離的大鼠T淋巴細胞ConA 刺激后，取細胞懸液，在避光條件下，加入鈣熒光指示劑Fluo-3/AM（3μmol/L）37℃孵育30min，之后用PBS 液漂洗3次，每次5min，靜置10min。將負載了Fluo-3/AM 指示劑的淋巴細胞懸液加入共聚焦專用皿中，采用激光掃描共聚焦掃描顯微鏡（Olympus，F(xiàn)V100

36、0）進行觀察，熒光強度（F值）來表示胞漿中鈣離子水平。
　　 結(jié)果：1大鼠脾臟CD3+T淋巴細胞分選成功首先將用免疫磁珠分選的大鼠CD3+T淋巴細胞用抗FITC-CD3+的抗體通過流式細胞儀進行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞占到92.2％（圖2-1）；隨后，用Guava 流式細胞分析儀進行細胞活性測定，分選后的活細胞>95％，光鏡下細胞形態(tài)均一，提示T淋巴細胞分選成功（圖2-2，2-3）。2大鼠T淋巴細胞表面無β1-AR的表達為了進一

37、步驗證在大鼠T淋巴細胞表面是否表達β1-AR，本研究利用免疫熒光化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)：DAPI 染色的淋巴細胞的核呈蘭色，在陰性對照組（圖2-4A）和實驗組（圖2-4B）均沒有檢測到FITC 標(biāo)記二抗的綠色熒光。提示：在大鼠的脾臟T淋巴細胞表面沒有檢測到β1-AR的表達。3 β1-AA對免疫磁珠分選后未經(jīng)ConA 激活的大鼠T淋巴細胞增殖沒有影響由于用免疫磁珠分選的大鼠T淋巴細胞中，除了含有大量的T（90％-95％）外，含有少量的其他單核細胞，

38、同樣為了檢測β1-AA對T細胞以及其他單核細胞是否有直接作用，我們將β1-AA 直接加入免疫磁珠分選后的細胞，發(fā)現(xiàn)：β1-AA對這些細胞的增殖沒有作用（P>0.05）（圖2-5）4 ConA 可以促進大鼠脾臟T淋巴細胞的增殖免疫磁珠分選的大鼠T淋巴細胞中加入ConA后，OD值達到0.38±0.04，明顯高于未加ConA的對照組的0.18±0.05（P<0.01），提示ConA 可以激活大鼠T淋巴細胞（圖2-6）。5 β1-AA 可以濃度

39、依賴性的促進ConA 激活的大鼠脾臟T淋巴細胞的增殖在ConA 激活的T淋巴細胞中，分別加入0.01，0.1，1μM的β1-AA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：OD值分別由原先的0.37±0.04，0.38±0.06，0.42±0.04 升高到0.50±0.04，0.61±0.02，0.68±0.05（P<0.01；P<0.01；P<0.01），提示β1-AA 可濃度依賴性地促進T淋巴細胞增殖（見圖2-7）。從陰性血清中提取的IgGs不能促進T淋巴細胞的增

40、殖；β1-AR細胞外第二環(huán)與該抗體進行預(yù)孵育，中和抗體后，該抗體促進T淋巴細胞的增殖作用消失（圖2-8）。6 β1-AA 促進大鼠T淋巴細胞的增殖的途徑為了進一步驗證β1-AA 促進T淋巴細胞增殖是否可以通過β2-AR，本研究發(fā)現(xiàn)：β1-AR阻斷劑Atenolol對β1-AA的促增殖作用沒有影響，但是可以被β2-AR 阻斷劑ICI118,551、β1-AR和β2-AR的拮抗劑Nadolol 以及非特異性的β-AR 阻斷劑Bupranol

41、ol 完全阻斷；單獨的Atenolol、ICI118,551、Nadolol 以及Bupranolol對T淋巴細胞的增殖沒有作用(圖2-9A，B)，這一結(jié)果提示β1-AA 促進T淋巴細胞的增殖作用可以通過β2-AR。加入β1-AA后，大鼠脾臟T淋巴細胞胞漿中cAMP水平升高，但是β1-AR 阻斷劑Atenolol對于cAMP的升高沒有影響，并且這種cAMP的升高可以被β2-AR 阻斷劑ICI118,551、β1-AR和β2-AR的阻斷劑

42、Nadolol 完全阻斷（圖2-10）；進一步的研究發(fā)現(xiàn)，PKA的阻斷劑H-89 以及PKC的抑制劑chelerythrine 均只能部分阻斷β-AA 誘導(dǎo)的T淋巴細胞的增殖；而PKA的抑制劑H-89和PKC的抑制劑chelerythrine 共同作用，可以完全抑制β-AA 誘導(dǎo)的T淋巴細胞的增殖（圖2-11）。這一結(jié)果提示：β1-AA 刺激大鼠脾臟T淋巴細胞的增殖可能主要是通過β2-AR-cAMP-PKA/β2-AR-PKC 途徑。7

43、 鈣離子在β1-AA 促進T淋巴細胞增殖中的作用7.1β1-AA 可以促進ConA 激活的大鼠脾臟T淋巴細胞胞內(nèi)鈣的明顯升高在ConA 刺激的大鼠脾臟T淋巴細胞中加入β1-AA后，胞內(nèi)的鈣離子的平均熒光強度F值由200±8.5 升高到628±25（P<0.01），并且，β1-AA 升高胞內(nèi)鈣的作用可以基本被β2-AR受體阻斷劑ICI118,551完全阻斷（P>0.05）（圖2-12,2-13）。這一結(jié)果提示：β1-AA 可以通過激活β2

44、-AR 使淋巴細胞中的胞內(nèi)鈣水平升高。7.2 阻斷胞漿中鈣離子的水平的升高可以不同程度抑制β1-AA 誘導(dǎo)的T淋巴細胞的增殖為進一步研究鈣離子在β1-AA 促進ConA 刺激T淋巴細胞增殖中的作用，本研究將ConA 激活的T淋巴細胞分別用L-型鈣通道阻斷劑維拉帕米、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜IP3 受體（IP3 R)阻斷劑肝素以及CRAC通道抑制劑SKF96365 預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)：β1-AA的促進T淋巴細胞增殖作用可以被部分抑制。（圖2-14）8 β1-

45、AA 可以促進大鼠T淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ及IL-4水平升高β1-AA（0.01，0.1，1μM）可濃度依賴性地促進大鼠T淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ及IL-4水平升高（圖2-15A，2-16A，2-17A）；這種細胞因子水平的升高不能被β1-AR 阻斷劑Atenolol 阻斷，可以被β2-AR 受體阻斷劑ICI118,551以及β1-AR和β2-AR的阻斷劑Nadolol、β-AR的非特異性阻斷劑Bupranolol 完

46、全阻斷（圖2-15B，2-16B，2-17B）。
　　 小結(jié)二1．Β1-AA 可以通過β2-AR-cAMP-PKA/β2-AR-PKC通路促進大鼠脾臟T淋巴細胞的增殖。2．Β1-AA 可以通過促進大鼠T淋巴細胞胞漿中鈣離子水平升高進而促進T淋巴細胞的增殖。3．Β1-AA 可以促進大鼠T淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-4分泌增加。
　　
　　 第三部分β1-AA 促進ConA 激活的人外周血T淋巴細胞的增殖

47、和分泌功能
　　 研究目的：以免疫磁珠分選的人外周血T淋巴細胞為研究對象，研究β1-AA對人外周血T淋巴細胞增殖和分泌功能的影響，同時探索其作用途徑。
　　 材料與方法：1. 實驗對象健康成人外周血。2. 實驗方法2.1人外周血CD3+T淋巴細胞的分選采用Ficoll-Hypaque 密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞；并用免疫磁珠分選CD3+T淋巴細胞。2.2 實驗分組2.2.1觀察β1-AA對分選的淋巴細胞增殖的影

48、響（1）溶劑對照組：分選的淋巴細胞加入溶劑生理鹽水；（2）β1-AA 處理組：分選的淋巴細胞直接加入β1-AA。2.2.2 觀察β1-AA對分選的T淋巴細胞活化特性的影響（1）溶劑對照組：分選的T淋巴細胞加入溶劑生理鹽水。（2）ConA組：給予分選的T淋巴細胞5μg/mL ConA 預(yù)刺激72h。將激活的T淋巴細胞懸液均勻接種于96孔細胞培養(yǎng)板（100μL/孔），每孔分別加入20μL 各種干預(yù)因素：2.2.3 觀察β1-AA對ConA

49、激活的T淋巴細胞是否有促增殖作用（1）溶劑對照組：生理鹽水；（2）陰性對照：β1-AA 陰性血清IgGs組（0.1μmol/L）；（3） 陽性對照組：不同濃度的β-AR 激動劑異丙腎上腺素組（ISO，0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L）；（4）不同濃度的β1-AA組（0.01μmol/L，0.1μmol/L，1μmol/L）；（5） β1-AA（0.1μmol/l）＋β1-AR抗原肽段組（3μmol/L）；2.2.

50、4 觀察不同干預(yù)對β1-AA對ConA 激活的T淋巴細胞增殖的影響（1）β1-AA（0.1μmol/l）+β1-AR 阻斷劑Atenolol組（1μmol/l）；（2）β1-AA（0.1μmol/l）+β2-AR 阻斷劑ICI118,551組（1μmol/L）；（3）β1-AA（0.1μmol/l）+β1/β2-AR 阻斷劑Nadolol組（1μmol/L）；（4）β1-AA（0.1μmol/l）+β-AR 阻斷劑Propranolol

51、組（1μmol/L）；（5）β1-AA（0.1μmol/l）+PKA 抑制劑H-89（1μmol/L）；（6）β1-AA（0.1μmol/l）+PKC 抑制劑Chelerythrine Chloride（1μmol/L）；（7） β1-AA（0.1μmol/l）+PKA 抑制劑H-89（1μmol/L）+PKC 抑制劑Chelerythrine（1μmol/L）；2.2.5 觀察單獨的阻斷劑對T淋巴細胞增殖的影響（1）β1-AR 阻斷劑

52、Atenolol組（1μmol/l）；（2）β2-AR 阻斷劑ICI118,551組（1μmol/L）；（3）β1/β2-AR 阻斷劑Nadolol組（1μmol/L）；（4）β-AR 阻斷劑Bupranolol組（1μmol/L）；（5）PKA 抑制劑H-89（1μmol/L）；（6）PKC 抑制劑Chelerythrine（1μmol/L）；2.3 Cell Counting Kit-8 （CCK-8）法檢測人外周血T淋巴細胞的增殖

53、見第二部分2.4 采用ELISA 試劑盒檢測T淋巴細胞cAMP水平以及細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ、IL-4含量見第二部分
　　 結(jié)果： 1β1-AA對分選的無ConA 刺激的人T淋巴細胞增殖無影響由于用免疫磁珠分選的人T淋巴細胞中，除了含有大量的T（90％-95％）淋巴細胞外，還含有少量的其他單核細胞，為了檢測β1-AA對T淋巴細胞以及少量單核細胞是否有直接作用，我們將β1-AA 直接加入免疫磁珠分選后的細胞，發(fā)現(xiàn)：β1

54、-AA對這些細胞的增殖沒有影響（P>0.05）（圖3-1）。2 ConA 可以促進人外周血T淋巴細胞的增殖免疫磁珠分選的人外周血T淋巴細胞中加入ConA后，未加ConA的對照組的OD值由原先的0.13±0.04 升高到0.38±0.06（P<0.01）（圖3-2），提示ConA 可以激活人外周血T淋巴細胞。3 β1-AA 可以促進ConA 激活的人外周血T淋巴細胞增殖3.1β1-AA 可以濃度依賴性的促進ConA 激活的人外周血T淋巴細

55、胞的增殖我們分別將濃度為0.01μM，0.1μM，1μM的β1-AA 加入ConA 刺激的人外周血T淋巴細胞中，經(jīng)CCK-8 法檢測，發(fā)現(xiàn)OD值分別由加入前的0.39±0.04，0.40±0.03，0.42±0.04，增加為0.47±0.05（P<0.05），0.61±0.04 （P<0.01）和0.67±0.05（P<0.01）（見圖3-3），提示β1-AA 可以濃度依賴性地促進ConA 刺激的人外周血T淋巴細胞增殖。為了證實該抗體作

56、用的特異性，本研究選用從陰性血清中提取的IgGs作為陰性對照作用于ConA 刺激的T淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)OD值0.38±0.04 改變?yōu)?.40±0.01（P>0.05），提示此種IgG不能促進ConA刺激T淋巴細胞的增殖；用合成的β1-AR-ECII與該抗體進行預(yù)孵育，將β1-AA中和后，OD值由單純加入自身抗體時的0.61±0.04 變化為0.39±0.009，提示β1-AA 促進T淋巴細胞的增殖作用消失（P<0.01）（圖3-4）。以上

57、結(jié)果提示，β1-AA 可以促進ConA 激活的人外周血T淋巴細胞的增殖。3.2 β1-AA 促進ConA 激活的人外周血T淋巴細胞增殖的可能機制4.2.1β1-AA 促進ConA 激活的人外周血T淋巴細胞的增殖可以通過β1-AR-cAMP-PKA 途徑為了探討β1-AA對T淋巴細胞的增殖作用是否通過β1-AR-cAMP-PKA 途徑，本研究進行了以下實驗。將ConA 激活的T淋巴細胞分別采用β1-AR 阻斷劑Atenolol和β-AR

58、阻斷劑Bupranolol預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)OD值由0.61±0.04分別變化為0.50±0.05（P<0.05）和0.40±0.03（P<0.01），提示β1-AA的促增殖作用不能被β1-AR的阻斷劑Atenolol 完全阻斷，但可以被β-AR 阻斷劑Bupranolol 完全阻斷（圖3-5A）；單獨的Atenolol和Bupranolol對T淋巴細胞的增殖沒有影響（P>0.05） (圖3-5B)，這一結(jié)果提示，β1-AA 促進ConA

59、激活的T淋巴細胞的增殖效應(yīng)可以部分通過β1-AR 發(fā)揮。加入β1-AA后，胞漿中cAMP水平由加入前的120±6.8pmol/mL 增加為300±7.5pmol/mL（P<0.01），提示β1-AA 可以使胞漿中cAMP水平升高，再分別加入β1-AR的阻斷劑Atenolol和β-AR 阻斷劑Bupranolol 以后，cAMP水平分別改變?yōu)?01±8.3（P<0.05）和125±8.9（P<0.01），提示CAMP水平的升高不能被β1-

60、AR 阻斷劑Atenolol 完全阻斷，但可以被β-AR 阻斷劑Bupranolol 完全阻斷（圖3-6）；進一步的研究發(fā)現(xiàn)，PKA的抑制劑H-89 也只能部分降低β1-AA 促進的T淋巴細胞的增殖效應(yīng)，OD值由0.61±0.04 變化為0.51±0.03（P<0.05）（圖3-7A），而單獨的H-89對ConA 刺激的T淋巴細胞的增殖沒有影響（P>0.05）（圖3-7B）。這一結(jié)果提示：β1-AA 有可能部分通過β1-AR-cAMP-

61、PKA 途徑，促進ConA 激活的人外周血T淋巴細胞的增殖。除了此途徑外，可能還有其他通路參與。3.2.2 β1-AA 促進ConA 激活的人外周血T淋巴細胞的增殖可以部分通過β2-AR-cAMP-PKA 途徑為了進一步分析β1-AA 促進人外周血T淋巴細胞增殖的作用途徑，本研究將β2-AR阻斷劑ICI118,551以及β1-AR和β2-AR 阻斷劑Nadolol分別作用于β1-AA 處理的的T淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)其促增殖作用也只能被ICI1

62、18,551部分阻斷，但是，Nadolol 可以完全阻斷β1-AA的促T淋巴細胞的增殖作用（圖3-8A），阻斷劑本身對ConA 激活的T淋巴細胞增殖沒有影響（圖3-8B），這一結(jié)果提示β1-AA的促增殖作用可以通過β2-AR 進行。而且升高的cAMP水平不能被ICI118,551完全阻斷，但可以被Nadolol 完全阻斷（P>0.05）（圖3-9）。這一結(jié)果提示：β1-AA 促進ConA 激活的人T淋巴細胞的增殖效應(yīng)除了通過β1-AR

63、外，還有β2-AR-cAMP-PKA 途徑參與。3.2.3 β1-AA 促進ConA 激活的人外周血T淋巴細胞的增殖還可以通過β1/β2-AR-PKC 途徑鑒于β1-AA的促增殖作用不能完全被PKA 抑制劑H-89 所完全阻斷，本研究選用PKC的抑制劑chelerythrine（白屈菜赤堿）作用于T淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)其可以部分抑制β1-AA 促進的T淋巴細胞的增殖作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，PKC和PKA的抑制劑共同干預(yù)也可以完全抑制β1-AA

64、 促進的T淋巴細胞的增殖（圖3-10）。由于β1/β2-AR的激活均可以激活PKC，那么，在β1-AA 促進人T淋巴細胞的增殖過程中涉及到的PKC是來自β1-AR 還是β2-AR的激活，本課題進行了如下實驗：首先將β2-AR 受體途徑阻斷（ICI118,551），再加入PKA的抑制劑H-89，發(fā)現(xiàn)，β1-AA的促增殖作用不能完全阻斷，繼續(xù)加入PKC 抑制劑chelerythrine后，β1-AA的促增殖作用才可完全被阻斷（圖3-11）。

65、而先將β1-AR 受體途徑阻斷（Atenolol），然后再加入H-89，也發(fā)現(xiàn)β1-AA的促增殖作用不能完全阻斷，再加入chelerythrine后，其增殖作用才可完全被阻斷（圖3-12）。這一結(jié)果提示：β1/β2-AR-PKC通路也是β1-AA 促進ConA 激活的人外周血T淋巴細胞增殖的途徑之一。4 β1-AA 可以促進ConA 激活的人外周血T淋巴細胞的分泌功能T淋巴細胞不同功能的發(fā)揮取決于分泌細胞因子的種類，本研究檢測了IL-2

66、，IFN-γ以及IL-4的分泌水平來反映機體細胞免疫和體液免疫功能。我們將不同濃度（0.01，0.1，1μM）的β1-AA分別作用于ConA 刺激的人外周血T淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)IL-2的分泌水平由加入前的26.3±3.1pg/ml，25.0±2.5 pg/ml，26.8±2.8pg/ml分別增加為33.2±2.4pg/ml （P<0.05），42.0±3.0pg/ml（P<0.01）和51±2.8pg/ml（P<0.01），IFN-γ的分泌

67、水平由43±3.2pg/ml，44±2.5pg/ml， 46±4.1pg/ml 增加為53±2.6pg/ml （P<0.05）， 68±3.0pg/ml （P<0.01）和73±3.4pg/ml（P<0.01），IL-4的分泌水平增加為33.0±3.2pg/ml（P<0.05），48.0±4.2pg/ml（P<0.01）和51±3.9pg/ml（P<0.01），遠高于處理前的24.0±2.6pg/ml，22±3.1pg/ml和23±3.

68、7pg/ml，提示β1-AA 可濃度依賴性地促進ConA 刺激的人外周血T淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ 以及IL-4水平（圖3-13A，3-14A，3-15A）。但是，從陰性血清中提取的IgGs不能促進這些細胞因子的生成增加，β1-AA 促進T淋巴細胞分泌這些細胞因子的作用可以被β1-AR細胞外第二環(huán)的抗原肽段中和（圖3-13B，3-14B，3-15B），提示：β1-AA 可以促進這些細胞因子的分泌。并且，這些細胞因子水平的升高可以

69、分別被β1-AR的選擇性阻斷劑Atenolol和β2-AR的阻斷劑ICI118,551部分阻斷；可以被β-AR的阻斷劑Bupranolol 以及β1-AR和β2-AR 阻斷劑Nadolol 完全阻斷（圖3-13C，3-14C，3-15C），提示：β1-AA 可以通過β1/β2-AR 促進這些細胞因子的分泌。
　　 小結(jié)三：1. Β1-AA能夠濃度依賴性促進ConA 刺激的人外周血T淋巴細胞增殖，并且這種作用可能是通過激活β1-A