抗β-,3-腎上腺素受體抗體對心衰大鼠心臟的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景：心力衰竭(心衰)是缺血性心臟病、高血壓病、瓣膜性心臟病等多種心血管疾病的共同終末階段。在中國，成年人心衰的患病率約為0.9％，隨著人口老齡化社會的發(fā)展，人群中心衰患者人數(shù)將不斷上升。目前針對心衰發(fā)病機(jī)制的多種治療手段雖能改善其癥狀，但心衰患者的5年生存率仍然低于50％，提示在心衰的發(fā)生發(fā)展過程中可能還有其他未知因素的參與。心衰的病理生理機(jī)制極其復(fù)雜，多種因素參與其發(fā)生發(fā)展。近年來發(fā)現(xiàn)，在部分心衰患者血清中存在有抗G-蛋白偶聯(lián)受

2、體家族中幾種主要受體(如腎上腺素β1受體、α1受體、膽堿能M2受體、血管緊張素Ⅱ1型受體)的自身抗體。進(jìn)一步的研究提示，這些自身抗體在心衰的發(fā)生發(fā)展中具有一定的病理生理意義。
　　 目的：⑴觀察β3AA能否減輕大鼠心衰的程度；⑵觀察β3AA是否能降低心衰大鼠對心肌缺血/再灌注損傷的敏感性。
　　 方法①選用8周齡、重量為140-160g、健康雄性Wistar大鼠20只，隨機(jī)分為對照組與免疫組。以合成的β3AR細(xì)胞外第二環(huán)

3、氨基酸肽段為抗原(176aa～200aa，R V G A D A E A Q EC H S N P R C C S F A S N M P，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海生物化學(xué)院)進(jìn)行免疫，每隔兩周免疫一次，共免疫8周。對照組只注射相應(yīng)佐劑，方法同免疫組。采用本實驗室改良的ELISA方法檢測免疫鼠血清中β3AA的水平。利用IgG親和純化試劑盒(Mab.Trap Kit)純化β3AA陽性的免疫大鼠血清中的IgG。將純化后的IgG進(jìn)行定量、定性，并常

4、規(guī)SDS-PAGE凝膠電泳法檢測其純度。②選用10周齡、重量為200-220g、健康雄性Wistar大鼠。用10％水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉后，在劍突下1 cm沿正中線作一切口，分離腹主動脈，將7號針頭與腹主動脈一并結(jié)扎，然后抽出探針形成腹主動脈狹窄(約50％)，同時腹腔一次性注射慶大霉素抗感染，分層縫合關(guān)腹。③將提純的β3AA陽性的IgG，以2μg/g的劑量，通過尾靜脈給入腹主動脈縮窄手術(shù)后3天的大鼠體內(nèi)，每10天加

5、強(qiáng)免疫一次，共免疫50天；免疫前1天，經(jīng)鼠尾取血樣，分離血清，用SA-ELISA法檢測其中β3AA的水平。對照組以2μg/g的劑量通過尾靜脈給入β3AA陰性的IgG，免疫程序和檢測方法同上。④應(yīng)用生物信號記錄分析系統(tǒng)MS2000記錄各心功能參數(shù)，包括左心室收縮壓(LVSP)，左心室舒張末壓(LVEDP)以及左心室內(nèi)壓上升和下降的最大速率(±dp/dtmax)。⑤開胸，迅速取出心臟，洗凈心腔內(nèi)積血，去除心臟周圍組織及血管，用濾紙吸干水分后

6、，稱量全心重，計算心臟重量與體重的比值。⑥血清中BNP的測定采用ELISA試劑盒(ADL，美國)進(jìn)行測定，具體操作按照說明書進(jìn)行。⑦取進(jìn)行腹主動脈縮窄術(shù)制備的心衰大鼠，用氨基甲酸乙酯(20％，1g/kg，i.p.)腹腔注射麻醉后，左冠脈前降支結(jié)扎30 min后，松開結(jié)扎線再灌注3 h；假手術(shù)組大鼠手術(shù)操作相同，將縫合針穿過左冠脈前降支下方，但不結(jié)扎。⑧應(yīng)用TTC染色法，測定β3AA輸入的心衰大鼠經(jīng)歷心肌缺血/再灌注手術(shù)后心肌梗死面積。⑨

7、應(yīng)用Caspase3測定試劑盒，檢測大鼠心肌組織中caspase3的活性。⑩利用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit，POD)，檢測大鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡數(shù)量，并計算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。
　　 結(jié)果：⑴腹主動脈縮窄術(shù)后8周，大鼠LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯下降，LVEDP明顯升高，心功能開始下降；腹主動脈縮窄術(shù)后12周、16周，大鼠心功能進(jìn)行性惡化。⑵腹主

8、動脈縮窄術(shù)后8周，大鼠血清中β3AA明顯升高(0.31±0.02 vs.0.22±0.05，P＜0.05)，術(shù)后12周達(dá)到高峰，之后開始下降。以上結(jié)果提示，腹主動脈縮窄術(shù)后0～8周是大鼠心功能從正常到明顯下降的過程，是大鼠心衰發(fā)生發(fā)展非常重要的時期；而且此期間，是β3AA產(chǎn)生的過程，體外給予β3AA可以單純研究其對大鼠心臟的保護(hù)作用。因此本研究選擇在腹主動脈縮窄術(shù)后0～8周，研究在大鼠心衰發(fā)生發(fā)展過程中，β3AA對心臟功能的影響。⑶腹主

9、動脈縮窄術(shù)后8周，大鼠LVSP和+dp/dtmax明顯下降，LVEDP和-dp/dtmax顯著升高。說明，腹主動脈縮窄術(shù)后8周，大鼠心衰模型制備成功。⑷與偽手術(shù)組相比，腹主動脈縮窄術(shù)后8周大鼠心重/體重比明顯增大。提示，心衰大鼠心臟發(fā)生了心肌重構(gòu)。以上結(jié)果提示，腹主動脈縮窄術(shù)后8周，大鼠心臟已經(jīng)發(fā)生明顯的心肌重構(gòu)，而且心功能已經(jīng)表現(xiàn)出失代償現(xiàn)象。⑸分別以0.5μg/g、1μg/g、2μg/g的劑量，將β3AA輸入腹主動脈縮窄術(shù)后的大鼠，

10、免疫后第1天，采血檢測大鼠血清中β3AA的水平。以2μg/g輸入后，大鼠血清中β3AA的平均OD值為0.67，與臨床相匹配，故作為最終免疫劑量。⑹應(yīng)用ELISA法對β3AA的IgG亞類鑒定結(jié)果表明，免疫鼠中的β3AA主要屬于IgG2b，還有極少部分屬于IgG2a。有研究表明不同的IgG亞類具有不同的代謝半衰期，IgG2b亞類的代謝半衰期為6天左右，IgG2a亞類的代謝半衰期為8天左右。明確β3AA的主要IgG亞類則可以為輸入周期的選擇提

11、供一定的理論依據(jù)。⑺β3AA輸入腹主動脈縮窄術(shù)后大鼠第1天，大鼠血清中抗體水平增高，平均OD值為0.67，與對照組相比增高了0.35。抗體水平下降其增高值的一半所需的時間大約為10天。因此本研究將免疫周期確定為10天。⑻以2μg/g為免疫劑量，10天為免疫周期，β3AA輸入腹主動脈縮窄術(shù)后大鼠，定期監(jiān)測大鼠血清中β3AA水平，發(fā)現(xiàn)該抗體水平能夠穩(wěn)定維持(圖11)。提示β3AA輸入心衰大鼠模型制備成功。⑼血清BNP水平與心力衰竭的臨床嚴(yán)重

12、程度相平行。實時監(jiān)測心衰大鼠血清中BNP的水平，腹主動脈縮窄術(shù)后2周的心衰大鼠，血清中BNP開始有輕度升高；術(shù)后6周，β3AA輸入心衰大鼠組血清中BNP水平升高程度低于未進(jìn)行β3AA輸入的心衰大鼠組；術(shù)后8周，β3AA輸入心衰大鼠組血清中BNP的水平較β3AA未免疫心衰大鼠組明顯降低。提示，β3AA輸入組大鼠心衰程度相對較輕。⑽腹主動脈縮窄術(shù)后8周，β3AA輸入組的+dp/dtmax及-dp/dtmax降低幅度均低于未免疫組。⑾β3AA

13、輸入心衰大鼠組經(jīng)歷心肌缺血/再灌注手術(shù)后，發(fā)現(xiàn)β3AA的輸入可以明顯延長大鼠心肌缺血/再灌注手術(shù)后的生存時間。⑿β3AA輸入心衰大鼠組，經(jīng)歷心肌缺血/再灌注手術(shù)后，心梗面積較對照組明顯減小。⒀β3AA輸入心衰大鼠組，經(jīng)歷心肌缺血/再灌注手術(shù)后，TUNEL染色陽性細(xì)胞明顯減少，心肌組織caspase-3活性明顯降低。
　　 結(jié)論：①β3AA輸入壓力后負(fù)荷性心衰大鼠后，可以使其心功能惡化程度明顯減輕、血清中BNP釋放減少；②當(dāng)心衰大