抗β-,1-腎上腺素受體細胞外第二環(huán)自身抗體導致大鼠多臟器損傷及其相關機制.pdf

1、研究背景和目的：β腎上腺素受體(β—adrenoceptor，β—AR)是交感神經(jīng)系統(tǒng)的重要成員，通過介導體內(nèi)兒茶酚胺類物質的生理效應，在調(diào)節(jié)心臟活動中發(fā)揮著重要作用。β—AR屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，目前已確認的β1、β2和β3AR三個亞型具有相同的結構特征，即含有由7個22～28個疏水性氨基酸殘基組成的跨膜區(qū)，連接這些跨膜區(qū)的親水性氨基酸片段構成了3個細胞內(nèi)環(huán)和3個細胞外環(huán)。在這三種β—AR亞型中，β1AR在心臟的分布密度最高。當該受

2、體受神經(jīng)、體液因素調(diào)節(jié)激活時，通過興奮型G蛋白—腺苷酸環(huán)化酶—環(huán)磷酸腺苷系統(tǒng)，使心臟產(chǎn)生正性變時、正性變力、正性變傳導效應，以適應機體對血液供應的需求。 Ⅰ．抗β1-AR-ECⅡ抗體可導致心肌重構及可能的機制。 第一分題：抗β1-AR-ECⅡ抗體可導致心肌結構重構及可能的機制。 目的： 1．觀察抗β1-AR-ECⅡ抗體被動免疫過程中，大鼠心肌形態(tài)學及心功能的變化情況； 2．觀察被動免疫過程中，細胞

3、內(nèi)游離鈣水平及CaMKⅡδ的表達情況。 方法： (1)分別選取健康成年雄性Wistar大鼠(n=60，體重180～220g)，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，用ELISA法篩選血清抗β1AR-ECⅡ抗體陰性的動物進行分組。 (2)肽段合成：抗原肽段由吉爾生化上海有限公司合成，相當于人β1-AR細胞外第二環(huán)氨基酸序列的特異性抗原決定簇(197-223位，HWW RAESDEARRCYNDPKCCDFVT NRA)，

4、合成肽段純度為95％(見表1)。合成的肽段儲存于-20℃?zhèn)溆谩?(3)通過大鼠尾靜脈定期給入抗體建立被動免疫模型，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測免疫過程中大鼠血清中抗β1—AR—ECⅡ抗體水平的變化； (4)分別用體視學指標、Masson三色染色及心重體重比的測量來反映被動免疫過程中大鼠心臟結構的變化； (5)經(jīng)右側頸總動脈插管進入左心室，監(jiān)測心率(Heartrates，HR)、左心室收縮壓(Left ve

5、ntricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張壓(Left ventricular diastolic pressure，LVDP)和左心室壓力變化最大速率(±dp/dtmax)等心功能指標； (6)分別采用原位末端標記法(TUNEL)和Caspase-3、8、9活性測定法檢測大鼠心肌組織中心肌細胞凋亡發(fā)生情況； (7)用Fluo-3—AM探針標記，激光共聚焦測定被動免疫末期大鼠單個心室肌

6、細胞內(nèi)游離鈣離子的水平； (8)用Western—blot及免疫組化法檢測大鼠心肌組織中CaMKⅡδ蛋白的表達水平。 第二分題：抗β1—AR—ECⅡ抗體導致心電重構及其可能的機制。 目的： 1．觀察抗β1—AR—ECⅡ抗體是否具有直接致心律失常的作用； 2．在組織和細胞水平，探討抗β1—AR—ECⅡ抗體致心律失常的可能機制，以求闡明抗β1—AR—ECⅡ抗體是否可致心電重構及其可能的機制，為臨床抗β

7、1—AR—ECⅡ抗體陽性心律失常患者的治療提供理論依據(jù)。 方法： (1)分別選取健康成年雄性Wistar大鼠(n=172)(其中因麻醉死亡5只，不明原因死亡5只)，體重180～220g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，用ELISA法篩選血清抗β1—AR—ECⅡ抗體陰性的動物進行分組。 (2)通過在體心功能及心電測定方法監(jiān)測給入抗β1—AR—ECⅡ抗體后正常大鼠心功能及心電圖的變化情況； (3)通過微電極記

8、錄動作電位的方法，觀察在組織水平抗β1—AR—ECⅡ抗體對乳頭肌動作電位的影響，同時分析動作電位時程(APD)的變化情況； (4)通過建立主動及被動免疫模型，觀察抗β1—AR—ECⅡ抗體長期存在對大鼠心電活動的影響，同時分析QT間期的變化； (5)通過膜片鉗技術及胞內(nèi)鈣熒光測定技術，觀察抗β1—AR—ECⅡ抗體長期存在對大鼠心肌細胞膜電流及胞內(nèi)鈣的影響。 結論： 1．抗β1—AR—ECⅡ抗體長期存在可導致

9、大鼠心肌重構及心功能障礙的發(fā)生，這可能與心肌細胞中游離鈣離子水平升高導致CaMKⅡδ的表達增加，進而誘導心肌細胞凋亡增加有關。 2．抗β1—AR—ECⅡ抗體可導致心律失常的發(fā)生，其機制可能與細胞膜靜息電位減小，Ik1、Ito及ⅠNa—Ca電流的減弱和ⅠCa—L電流的增強導致的胞內(nèi)鈣離子水平升高和動作電位時程延長有關。 Ⅱ．抗β1—AR—ECⅡ抗體長期存在可導致大鼠肝臟損傷。 目的:證實抗β1—AR—ECⅡ抗體長期

10、存在是否會對大鼠肝臟的結構和功能產(chǎn)生影響。 方法: (1)建立主動及被動免疫模型，用ELISA法檢測大鼠血清中抗β1—AR—ECⅡ抗體水平的變化； (2)用HE和Masson三色染色，觀察抗β1—AR—ECⅡ抗體長期存在對肝臟結構的影響； (3)通過檢測反映肝功能的血清學指標，來證實抗β1—AR—ECⅡ抗體長期存在對肝功能的影響。 結論：抗β1—AR—ECⅡ抗體長期存在可導致肝臟結構和功能的損傷，

11、因此，血清中存在高水平抗β1—AR—ECⅡ抗體時，應密切關注患者肝功能的變化。 Ⅲ．抗β1—AR—ECⅡ抗體長期存在可導致大鼠腎臟損傷。 目的：觀察抗β1—AR—ECⅡ抗體長期存在能否導致大鼠腎臟結構和功能的損傷。 方法： (1)建立主動及被動免疫模型，用ELISA法檢測大鼠血清中抗β1—AR—ECⅡ抗體水平的變化； (2)用HE和Masson三色染色，觀察抗β1—AR—ECⅡ抗體長期存在對腎臟結

12、構的影響； (3)通過檢測反映腎功能的血清學指標，來證實抗β1—AR—ECⅡ抗體長期存在對腎功能的影響。 結論：抗β1—AR—ECⅡ抗體長期存在會對腎臟結構及功能產(chǎn)生一定損傷，因此，血清中存在高水平抗β1—AR—ECⅡ抗體的患者應密切關注腎功能的變化情況。 本研究中存在一些不足之處：關于抗β1—AR—ECⅡ抗體致心肌細胞凋亡的信號通路研究中，只觀察到：在主動及被動免疫過程中，隨著免疫時間的延長心肌CaMKⅡδ的表

13、達逐漸增加，但尚缺乏抗β1—AR—ECⅡ抗體直接作用能否導致CaMKⅡδ的表達增加，以及抑制CaMKⅡδ后，抗β1—AR—ECⅡ抗體誘導的心肌細胞凋亡是否會減少等一系列問題，對于這些問題的解釋，將通過進一步的成鼠心肌細胞培養(yǎng)來證實。 本研究首次發(fā)現(xiàn)抗β1—AR—ECⅡ抗體可致肝腎損傷，但其如何導致肝腎損傷及其相關機制還有待進一步深入。 結論： 1．抗β1—AR—ECⅡ抗體長期存在可導致大鼠心肌重構及心功能障礙的發(fā)

14、生，這可能與心肌細胞中游離鈣離子水平升高導致CaMKⅡδ的表達增加，進而誘導心肌細胞凋亡增加有關。 2．抗β1—AR—ECⅡ抗體可導致心律失常的發(fā)生，其機制可能與細胞膜靜息電位減小，Ik1、Ito及INa—Ca電流的減弱和ICa—L電流的增強導致的胞內(nèi)鈣離子水平升高和動作電位時程延長有關。 3．抗β1—AR—ECⅡ抗體長期存在可導致一定程度的肝腎損傷。環(huán)中產(chǎn)生的抗β1-AR-ECⅡ抗體是否也能通過與肝臟和腎臟細胞表面的β

15、1-AR結合，從而產(chǎn)生一定的作用呢? 前期在用β1—AR—ECⅡ肽段進行18個月的主動免疫大鼠過程中觀察到：有相當數(shù)量的大鼠出現(xiàn)了腹水和肝緣變鈍的現(xiàn)象，引起本研究的極大關注。對于腹水的臨床檢驗結果表明：腹水中細胞數(shù)及蛋白水平偏高，葡萄糖水平偏低，同時腹水可以自然凝固，基于以上性質確定該腹水為滲出液，而非漏出液；同時結合大鼠的心功能狀況判定，腹水不是由于心衰而導致的，那么形成腹水的原因是什么，尚不得而知；但結合肝緣變鈍這一大體現(xiàn)象，考慮肝

16、臟病變可能是形成腹水的原因之一，但不能排除腎臟在免疫過程中是否也受到損傷。因此在本課題中，也將對這一問題進行初步探索。 綜上所述，本課題擬進行以下三方面的研究： ①采用被動免疫模型，探討抗β1-AR-ECⅡ抗體長期存在是否會導致心肌組織CaMKⅡδ表達的改變，同時觀察心肌細胞內(nèi)鈣離子水平的變化；觀察抗β1-AR-ECⅡ抗體致心律失常的直接作用、長期作用及其可能的機制； ②建立主動及被動免疫模型，觀察抗β1-AR-