抗AT1受體細(xì)胞外第二環(huán)肽抗體參與動脈粥樣硬化發(fā)病的機制研究.pdf

1、第一部分、兔抗人AT1 受體細(xì)胞外第二環(huán)肽抗體的制備提純及鑒定
　　 目的：利用人工合成的AT1 受體細(xì)胞外第二環(huán)肽段免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，提純并對其生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定。以期了解抗AT1 受體自身抗體在動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的作用，從自身免疫角度對該病的診治提供指導(dǎo)。
　　 方法及結(jié)果：根據(jù)人AT1 受體細(xì)胞外第二環(huán)肽段氨基酸序列，人工合成多肽，用化學(xué)方法與載體牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)，免疫新西蘭大白兔，E

2、LISA 法檢測抗體滴度，合成的肽段有良好的免疫原性，在接受第二次免疫后一周兔體內(nèi)抗體開始升高，第五次免疫后一周ELISA 檢測抗體反應(yīng)效價達(dá)到峰值1：409 600，收獲兔抗血清。免疫親和層析法提純抗血清，SDS-PAGE 法鑒定純化后抗體的純度呈單一清晰蛋白帶；Western blot 方法檢測結(jié)果顯示，制備的抗AT1 受體抗體與AT1 受體蛋白在分子量40KD處結(jié)合，形成唯一顯色帶，與AT1 受體蛋白分子量一致；細(xì)胞免疫熒光法檢測

3、觀察到制備的抗體在細(xì)胞膜表面與AT1 受體結(jié)合，與AT1 受體是膜受體的細(xì)胞定位結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：所制備的兔抗人多克隆抗體可特異性識別AT1 受體，為后續(xù)針對該抗體細(xì)胞分子水平實驗研究打下良好基礎(chǔ)。
　　 第二部分、抗AT1 受體細(xì)胞外第二環(huán)肽段抗體對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MCP-1的影響及相關(guān)信號傳導(dǎo)機制研究
　　 目的：研究制備的兔抗人AT1 受體細(xì)胞外第二環(huán)肽段抗體（AT1-AA）對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（H

4、UVECs）表達(dá)MCP-1 （單核細(xì)胞趨化因子-1）的影響及相關(guān)信號機制。從細(xì)胞蛋白、分子水平探討AT1-AA 對內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響以明確它們在動脈粥樣硬化（AS）發(fā)生發(fā)展中的地位和相互關(guān)系，以及AT1 受體拮抗劑可能的抗AS 作用。
　　 方法及結(jié)果：將AT1-AA與HUVECs 共孵育，設(shè)不同的稀釋度和孵育時間點檢測MCP-1的表達(dá)，取MCP-1表達(dá)量最大的1：20 稀釋，與HUVECs 共孵育12 小時。用West

5、ern blot和PT-PCR方法檢測細(xì)胞MCP-1 蛋白和mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示：與抗體陰性組比較AT1-AA與HUVECs 共孵育后MCP-1 蛋白和mRNA表達(dá)明顯增高，氯沙坦可顯著抑制AT1-AA 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1表達(dá)。PDTC (吡咯二硫氨基甲酸脂)是NF-κ B P65特異性抑制劑，用不同濃PDTC （5，10，20 μmo l/L）預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞1 小時后，加1：20 稀釋的AT1-AA 作用HUVECs 12h收

6、獲細(xì)胞，用Western blot和PT-PCR方法檢測細(xì)胞MCP-1和P65蛋白及mRNA表達(dá)量變化，以不加PDTC組為對照。結(jié)果顯示：與對照組比較，PDTC 干預(yù)組隨著PDTC 濃度升高，MCP-1 蛋白和mRNA表達(dá)量均降低(P<0.05)，P65蛋白和mRNA表達(dá)量也降低(P<0.05)。直線相關(guān)分析顯示，MCP-1表達(dá)水平與PDTC 濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，P65表達(dá)水平與PDTC 濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，提示PDTC 呈濃度依賴性下調(diào)M

7、CP-1的表達(dá)，同時下調(diào)P65的表達(dá)。
　　 結(jié)論：AT1-AA 可通過NF-κ B 途徑，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞下游靶基因（炎癥因子MCP-1）表達(dá)促進(jìn)單核細(xì)胞粘附內(nèi)皮，可能是AT1 受體自身抗體參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的機制之一。
　　 第三部分、抗AT1 受體細(xì)胞外第二環(huán)肽段抗體對THP-1 源性泡沫細(xì)胞表達(dá)ABCA1 影響的實驗研究
　　 目的：通過研究AT1-AA 對THP-1 源性泡沫細(xì)胞表達(dá)ABCA1 （AT

8、P 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1）的影響，從細(xì)胞蛋白、分子水平探討AT1-AA 對泡沫細(xì)胞脂質(zhì)轉(zhuǎn)移受體表達(dá)的影響，以期明確其在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的地位和相互關(guān)系以及AT1 受體拮抗劑可能的抗AS 作用。
　　 方法及結(jié)果：將THP-1 單核細(xì)胞用PMA 誘導(dǎo)分化成貼壁的巨噬細(xì)胞，給予ox-LDL脂負(fù)荷，誘導(dǎo)其成為泡沫細(xì)胞細(xì)胞,顯微鏡下觀察可見細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，融合，胞漿內(nèi)有顆粒狀物，油紅O 染色見細(xì)胞內(nèi)大量脂滴，酶熒光化學(xué)法檢測細(xì)胞內(nèi)含

9、大量膽固醇，顯示構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型成功。將AT1-AA與泡沫細(xì)胞共孵育，Western blot和PT-PCR方法檢測細(xì)胞ABCA1的表達(dá)mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示：與對照組相比AT1-AA 顯著抑制ABCA1 蛋白和mRNA的表達(dá)，血管緊張素II組相比無顯著差異，氯沙坦能顯著減輕AT1-AA 對ABCA1 蛋白和mRNA表達(dá)的抑制作用，但表達(dá)量仍顯著低于陰性對照組。
　　 結(jié)論：AT1-AA下調(diào)THP-1 源性泡沫細(xì)胞表達(dá)AB