血管緊張素Ⅱ AT-,1-受體自身抗體對大鼠心室肌細胞動作電位和心肌變力性的影響.pdf

1、本實驗著重觀察了AT<,1>-R AA對大鼠心室肌細胞動作電位和相關離子電流，以及心肌變力性的影響。 研究材料和方法： 1、AT<,1>受體自身抗體的制備。 1．1 AT<,1>受體抗原肽段的合成：按照人AT<,1>受體細胞外第二環(huán)的功能表位肽段(165-191位，氨基酸序列為I-H-R-N-V-F-F-I-E-N-T-N-I-T-V-C-A-F-H-Y-E-S-Q-N-S-T-L)由西安美聯(lián)生物科技有限公司合成

2、。 1．2抗體制備：使用上述抗原肽段對Wistar大鼠進行為期8周的主動免疫，制備抗AT<,1>受體抗血清，其效價用SA-ELISA方法檢測。然后利用MAb Trap Kit試劑盒對抗血清中的抗體IgG進行提取和純化。純化后的抗體蛋白液混合后，先經(jīng)PAGE膠凝膠電泳檢測其純度，然后使用考馬斯亮蘭試劑盒對抗體進行定量。 2、心室肌細胞動作電位和離子電流的測定。 2．1細胞分離：取健康Wistar大鼠，用Langen

3、dorff灌流裝置經(jīng)主動脈逆行灌流酶解心臟為單個心肌細胞，選取橫紋清晰、膜良好的心肌細胞進行實驗。 2．2全細胞膜片鉗記錄方法：細胞復鈣，于倒置顯微鏡下觀察，細胞充分貼壁后用臺氏液灌流。兩步拉制玻璃電極，充灌電極內(nèi)液，與細胞封接后破膜，記錄心室肌細胞動作電位和L-型鈣離子通道電流(I<,Ca-L>)。 2．3分組：(1)正常對照組(control，n=6)，正常臺氏液灌流；(2)陰性IgG組(negativeIgG,n=

4、6)，給予陰性IgG；(3)AT<,1>受體自身抗體組(AT<,1>-R AA，n=6)，給予AT<,1>受體自身抗體IgG；(4)AT<,1>受體自身抗體加AT<,1>受體阻斷劑組(AT<,1>-R AA+losartan,n=6)，同時給予AT<,1>受體自身抗體和AT<,1>受體阻斷劑losartan：(5)血管緊張素-Ⅱ組(Ang-H，n=6)，給予100 nmol/L，的Ang-Ⅱ；(6)血管緊張素-Ⅱ加AT<,1>受體阻斷劑

5、組(Ang-Ⅱ+losartan，n=6)，同時給予Ang-Ⅱ和losartan。AT<,1>-R AAIgG均分別按照10nmol/L、20nmol/L和50nmol/L三個濃度進行處理，觀察大鼠心室肌細胞L型Ca<'++>通道電流(I<,Ca-L>)電流密度的變化和動作電位時程的變化，并與100 nmol/L的Ang-Ⅱ的作用進行比較。另外還同時觀察了AT<,1>受體選擇性拮抗劑losartan對抗體IgG的作用的影響。 3

6、、在體大鼠心功能的測定。健康雄性成年Wistar大鼠，體重250-280g，隨機分為5組：正常對照組(生理鹽水)，AT<,1>受體自身抗體組(生理鹽水+AT<,1>受體自身抗體)，AT<,1>受體自身抗體加AT<,1>受體阻斷劑組(生理鹽水+AT<,1>受體自身抗體+losartan)，血管緊張素-Ⅱ組(生理鹽水+losartan)和血管緊張素-Ⅱ加AT<,1>受體阻斷劑組(生理鹽水+Ang-Ⅱ+losartan)，每組5只。稱重后經(jīng)腹

7、腔注射氨基甲酸乙酯(20％，1g/kg)麻醉，經(jīng)右頸總動脈行左心室插管，經(jīng)股靜脈注射藥物給予不同處理，由ms2000生物信號記錄分析系統(tǒng)記錄左心室壓力和左心室壓力變化率等心功能指標。 研究結果： 1、利用AT<,1>受體細胞外第二環(huán)表位功能肽段主動免疫大鼠的結果： 免疫大鼠血清中AT<,1>受體自身抗體滴度的變化從免疫后的第二周開始升高(圖1：表1)。第二次加強免疫后的第二周(總第八周)，大鼠血清中的抗體滴度，從

8、免疫前的1：25.56±9.22升高到1：1490.00±847.58(P<0.01)。對照組的血清抗體未見明顯變化。 2、AT<,1>受體自身抗體蛋白定性及定量測定結果： PAGE膠凝膠電泳檢測結果顯示，純化后的抗體在電泳時，僅有一條條帶出現(xiàn)，分子量為160KDa左右，與IgG標準品相一致，表明純化結果理想。同時，經(jīng)考馬斯亮蘭試劑盒測定蛋白濃度為2.38mg/mL。 3、AT<,1>受體自身抗體對大鼠心室肌細胞

9、動作電位時程(APD<,50>和APD<,90>)的影響： 給予AT<,1>受體自身抗體后的作用結果顯示，該抗體可以使大鼠心室肌細胞動作電位的50％復極化時間(APD<,50>)和90％復極化時間(APD<,90>)均呈劑量依賴性縮短(圖3，圖5，表2，圖5)。經(jīng)過正常臺氏液的灌流，APD<,50>和APD<,90>可以大部分恢復，證明該縮短變化是由AT<,1>受體自身抗體作用產(chǎn)生的(圖2)。 為驗證抗體對AT<,1>受

10、體的效應，對比觀察了AT<,1>受體激動劑Ang-Ⅱ的作用。結果顯示，Ang-Ⅱ的作用與AT<,1>受體自身抗體的作用是一致的，它也可使動作電位時程(APD<,50>和APD<,90>)明顯縮短(圖4，表3)。 AT<,1>受體自身抗體與受體激動劑Ang-Ⅱ的作用均可被，AT<,1>受體選擇性拮抗劑losartan所阻斷。如圖(3，4)所示，給予100nmol/L的Losartan后，可以幾乎完全拮抗上述Ang-Ⅱ和AT<,1>

11、受體自身抗體對于動作電位APD<,50>和APD<,90>縮短的作用，證明該抗體是通過AT<,1>受體而產(chǎn)生作用的。 4、AT<,1>受體自身抗體對大鼠心室肌細胞I<,Ca-L>的影響結果顯示，10nmol/L、20nmol/L、50nmol/L濃度的抗AT<,1>受體自身抗體可以明顯增加I<,Ca-L>電流，并呈劑量依賴性效應(圖7，圖9，表4)。例如50nmol/L的AT<,1>受體自身抗體可以使I<,Ca-L>電流由給藥前

12、4.11±0.58(pA/pF)增加到8.55±0.13(pA/pF)(P<0.01)。經(jīng)過正常臺氏液的灌流，該增加部分可以大部分恢復，證明該增加作用是由AT<,1>受體自身抗體作用產(chǎn)生的，而非膜電流不穩(wěn)定所致(圖6)。 100nmol/L的Ang-Ⅱ作用的結果顯示，AT<,1>受體激動劑Ang-Ⅱ的作用與AT<,1>受體自身抗體的作用是一致的，它也可以顯著增加I<,Ca-L>電流(圖8，表5)。 給予100nmol/L

13、的AT<,1>受體選擇性拮抗劑losartan后，可以幾乎完全拮抗上述Ang-Ⅱ和AT<,1>受體自身抗體對于該電流的增強作用，證明該抗體也是通過AT<,1>受體而產(chǎn)生作用的(圖7,8)。 5、AT<,1>受體自身抗體對于抑制鈉一鈣交換電流(I<,Na/Ca>)后的大鼠心室肌細胞動作電位的影響本實驗室以前的研究證實.AT<,1>受體抗體除可增強I<,Ca-L>電流外，還可增強鈉一鈣交換電流(I<,Na/Ca>)。為分析AT<,1

14、>受體抗體縮短心肌細胞動作電位時程的機理，我們還觀察了用鋰離子取代鈉離子進行灌流，抑制鈉一鈣交換電流(I<,Na/Ca>)的情況下，AT<,1>-R AA對動作電位時程的影響。結果表明，在抑制鈉一鈣交換電流(I<,Na/Ca>)后，可見動作電位時程縮短(圖10)，在此基礎上給予AT<,1>受體自身抗體，則未再引起大鼠心肌細胞動作電位APD<,50>和APD<,90>的改變(圖11，表6)。在此條件下給予Ang-Ⅱ，其結果也與AT<,1>

15、受體自身抗體的作用一致，未再引起大鼠心肌細胞動作電位APD<,50>和APD<,90>的改變(圖12，表7)。 6、AT<,1>受體自身抗體對大鼠心功能的影響AT<,1>受體自身抗體可顯著升高大鼠LVSP、dp/dtmax和-dp/dtmax。Ang-Ⅱ的作用與AT<,1>受體激動劑Ang-Ⅱ的作用一致(圖13，圖14，圖15)。給予AT<,1>受體選擇性拮抗劑losartan后，可以大部分消除上述Ang-Ⅱ和AT<,1>受體自身抗體對

16、于心功能的改變，證明該抗體通過AT<,1>受體發(fā)揮作用。 研究結論： 1．按照人血管緊張素Ⅱ受體-Ⅰ亞型(AT<,1>受體)細胞外第二環(huán)功能表位肽段(165～191位)的氨基酸序列合成的肽段作為抗原，主動免疫Wistar大鼠，成功獲得了高滴度的AT<,1>受體自身抗體(AT<,1>-R AA)，并利用高特異性的親和柱提取后，得到較為理想的足量的純化IgG，借以進行抗體對心臟活動的生物學效應研究。 2．AT<,1>

17、-R AA能顯著縮短心肌細胞動作電位時程(APD<,50>和APD<,90>)，其作用與AT<,1>受體激動劑Ang-Ⅱ的效應是一致的，提示該抗體對AT<,1>受體有激動劑樣效應。此效應可被AT<,1>受體特異性阻斷劑所阻斷，說明該抗體作用是通過AT<,1>受體介導實現(xiàn)的。AT<,1>-R AA縮短動作電位時程的機制，可能與其促進鈣離子內(nèi)流(增強心室肌細胞I<,Ca-L>)，繼而促進鉀離子外流有關。 3．AT<,1>-R AA能