機(jī)械刺激直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞血管緊張素Ⅱ-1型受體活化的機(jī)制.pdf

1、心肌細(xì)胞膜血管緊張素Ⅱ-1型(AT1)受體的過(guò)度活化是心肌肥厚發(fā)生、發(fā)展的重要原因。AT1受體敲除或活性受抑均可以有效的緩解壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚和損傷的進(jìn)展。近年來(lái)研究表明,AT1受體不但可以被其配體血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)所激活,而且還可以直接被機(jī)械刺激所活化,繼而引起心肌肥厚。機(jī)械刺激直接激活A(yù)T1受體是一個(gè)全新的發(fā)現(xiàn),目前對(duì)其發(fā)生機(jī)制、調(diào)控因素以及引發(fā)心肌肥厚的主要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑均不明確。本研究在內(nèi)源性AngⅡ缺失的細(xì)胞株

2、(COS7細(xì)胞和HEK293細(xì)胞)中分別轉(zhuǎn)染野生型AT1受體和鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)質(zhì)粒,然后給予體外機(jī)械牽張,證實(shí)了CaMKⅡ?qū)τ跈C(jī)械牽張激活A(yù)T1受體具有重要作用。另外我們?cè)诓槐磉_(dá)AngⅡ的血管緊張素原基因敲除(ATG-/-)小鼠中實(shí)施主動(dòng)脈縮窄(trarlsverseaortaconstriction,TAC)手術(shù)構(gòu)建了壓力超負(fù)荷心肌肥厚模型,并給予AT1受體阻斷劑Losartan和特異性CaMKⅡ抑制劑KN93干預(yù)。結(jié)果表

3、明持續(xù)2周的TAC在ATG-/-小鼠中引起了顯著的代償性心肌肥厚,Losartan和KN93在沒有明顯影響血流動(dòng)力學(xué)的情況下均有效的緩解了心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。在機(jī)械刺激誘導(dǎo)肥厚的心肌細(xì)胞中,CaMKⅡ向心肌細(xì)胞膜聚集定位并與AT1受體結(jié)合,Losartan可以抑制二者結(jié)合,而KN93對(duì)二者之間的結(jié)合無(wú)顯著抑制作用。在構(gòu)建不同部位的CaMKⅡ突變體并將其和野生型AT1受體共轉(zhuǎn)染進(jìn)COS7細(xì)胞之后,牽張并檢測(cè)肥厚反應(yīng),發(fā)現(xiàn)將CaMKⅡ中間自

4、我抑制結(jié)構(gòu)敲除之后,對(duì)AT1受體的感受機(jī)械刺激能力的抑制最為顯著,因此推測(cè)CaMKⅡ與AT1受體蛋白的結(jié)合位點(diǎn)可能出于其中間結(jié)構(gòu)域。鑒于鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)在AT1受體介導(dǎo)的AngⅡ致心肌肥厚的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中的核心地位,我們推測(cè)CaN可能在AT1受體介導(dǎo)的細(xì)胞外機(jī)械信號(hào)的胞內(nèi)信號(hào)通路中也扮演者重要的角色。因此我們?cè)趬毫Τ?fù)荷構(gòu)建的的ATG-/-小鼠心肌肥厚模型中以Losartan和特異性的CaN抑制劑FK506干預(yù),證實(shí)Losar

5、tan和FK506均有效抑制了壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚,抑制AT1受體活性也顯著性降低了心肌細(xì)胞內(nèi)的CaN表達(dá),證實(shí)CaN是AT1受體介導(dǎo)的細(xì)胞外機(jī)械信號(hào)的不可或缺的胞內(nèi)信號(hào)蛋白。
　　綜合以上研究結(jié)果,我們認(rèn)為機(jī)械刺激引起心肌細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ向膜聚集并與AT1受體結(jié)合和相互作用,使得AT1受體可以直接被機(jī)械刺激活化并介導(dǎo)心肌肥厚。某些AT1受體阻斷劑如Losartan可以抑制CaMKⅡ與AT1受體之間的結(jié)合,而CaMKⅡ與AT1

6、受體的結(jié)合部位可能位于其中間自我抑制結(jié)構(gòu)。在AT1受體介導(dǎo)的心肌細(xì)胞外機(jī)械刺激的信號(hào)通路中,CaN是其中重要的信號(hào)分子。
　　第一部分，CaMKⅡ參與了機(jī)械刺激直接誘導(dǎo)的AT1受體激活
　　目的:驗(yàn)證CaMKⅡ是否參與了機(jī)械刺激直接誘導(dǎo)的AT1受體活化過(guò)程。
　　方法:在硅膠皿培養(yǎng)的COS7細(xì)胞中單轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染野生型CaMKⅡ與AT1受體質(zhì)粒,機(jī)械牽張8分鐘后收集細(xì)胞總蛋白以免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)磷

7、酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignal-regulatedproteinkinases,p-ERKs)的表達(dá)水平,提取細(xì)胞總RNA,以逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)胎兒型基因ANP、BNP和骨骼肌α-肌動(dòng)蛋自(skeletal-αactin,SAA)基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果:在沒有轉(zhuǎn)染AT1受體質(zhì)粒的COS7細(xì)胞中,無(wú)論是AngⅡ還是牽張刺激,均不能引起p-ERKs和ANP、BNP以及SAA的表達(dá)上調(diào)。在單獨(dú)轉(zhuǎn)染AT

8、1受體但是沒有轉(zhuǎn)染CaMKⅡ質(zhì)粒的COS7細(xì)胞中,機(jī)械牽張引起了p-ERKs和ANP表達(dá)的輕度上調(diào)。在共轉(zhuǎn)染CaMKⅡ與AT1受體質(zhì)粒的COS7細(xì)胞中,牽張刺激引起了明顯的p-ERKs和ANP、BNP以及SAA的表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論:AT1受體是介導(dǎo)機(jī)械刺激引起的增殖反應(yīng)的最主要膜受體,CaMKⅡ參與了機(jī)械刺激活化AT1受體的過(guò)程。
　　第二部分，機(jī)械刺激誘導(dǎo)CaMKⅡ向心肌細(xì)胞膜聚集并與AT1受體結(jié)合
　　目的:研究

9、在機(jī)械刺激引起的心肌肥厚中,CaMKⅡ與心肌細(xì)胞膜AT1受體的關(guān)系。
　　方法:32只8-10周齡的血管緊張素原基因敲除(ATG-/-)小鼠被均分為4組:假手術(shù)+生理鹽水干預(yù)組,TAC+生理鹽水干預(yù)組,TAC+Losartan(3mg/Kg/d)干預(yù)組,TAC+KN93(3mg/Kg/d)干預(yù)組。生理鹽水和干預(yù)藥物溶液均通過(guò)術(shù)前3天埋植在小鼠背部皮下的滲透壓泵24小時(shí)持續(xù)給藥。TAC術(shù)后2周,所有小鼠在行經(jīng)胸心臟超聲測(cè)定心臟形態(tài)和

10、心功能,侵入性心導(dǎo)管檢測(cè)主動(dòng)脈以及左室壓力后處死,取心臟測(cè)量心重并計(jì)算心重體重比值,部分心臟石蠟包埋后HE染色測(cè)定心肌細(xì)胞橫截面積,部分心臟做冰凍切片以備后期免疫熒光觀察,部分心臟液氮凍存或者直接用于抽提總蛋白、膜蛋白或者總RNA。Western-blot檢測(cè)抽提總蛋白中p-ERKs表達(dá),檢測(cè)膜蛋白中CaMKⅡ和AT1受體蛋白表達(dá)。免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)檢測(cè)CaMKⅡ和AT1受體蛋白的結(jié)合

11、,用免疫熒光激光共聚焦成像方法觀察CaMKⅡ和AT1受體分布和共定位狀態(tài)。體外培養(yǎng)COS7細(xì)胞并轉(zhuǎn)染野生型CaMKⅡ和AT1受體質(zhì)粒,牽張刺激24小時(shí)后,提取細(xì)胞膜蛋白行Western-blot檢測(cè)膜CaMKⅡ含量,Co-IP檢測(cè)CaMKⅡ和AT1受體的結(jié)合。
　　結(jié)果:TAC手術(shù)在ATG-/-小鼠中顯著升高了主動(dòng)脈血壓和左心室收縮末期壓力,Losartan和KN93干預(yù)并沒有明顯影響TAC引起的血流動(dòng)力學(xué)異常。2周的TAC在AT

12、G-/-小鼠中引起了代償性心肌肥厚,心超表現(xiàn)為左心室前壁和后壁增厚,左心室內(nèi)徑減小,反應(yīng)性左心室射血分?jǐn)?shù)增加而左室短軸縮短率無(wú)明顯變化。TAC后2周小鼠心重體重比和心肌細(xì)胞橫截面積均顯著增加,肥厚相關(guān)標(biāo)志物包括p-ERKs和ANP、BNP和SAA表達(dá)均顯著升高,SERCA2表達(dá)下降。Losartan和KN93干預(yù)顯著抑制了左心室前、后壁增厚,左室內(nèi)徑的減小和左心室射血分?jǐn)?shù)異常,對(duì)FS無(wú)明顯改變,同時(shí)也顯著降低了心重體重比、心肌細(xì)胞橫截面

13、積和肥厚相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)異常。TAC引起心肌細(xì)胞膜CaMKⅡ表達(dá)明顯增加。Losartan顯著抑制了CaMKⅡ的在心肌細(xì)胞膜的表達(dá)上調(diào),KN93對(duì)心肌細(xì)胞膜的CaMKⅡ聚集抑制作用更為明顯。心臟切片免疫熒光證實(shí)TAC之后CaMKⅡ在心肌細(xì)胞膜區(qū)域高濃度聚集,KN93比Losartan更為顯著的抑制這種趨勢(shì)。Co-IP和免疫熒光發(fā)現(xiàn),TAC引起了CaMKⅡ和AT1受體在心肌細(xì)胞膜結(jié)合,Losartan可以明顯抑制二者的結(jié)合,而KN93對(duì)二

14、者結(jié)合的抑制作用不明顯。在體外培養(yǎng)的COS7細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型CaMKⅡ和AT1質(zhì)粒,牽張刺激24小時(shí)后的受體的膜蛋白檢測(cè)提示機(jī)械牽張促使CaMKⅡ向細(xì)胞膜聚集并和AT1受體結(jié)合。
　　結(jié)論:機(jī)械刺激引起心肌細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ向膜聚集并與AT1受體結(jié)合,可能是AT1受體直接被機(jī)械刺激活化的重要機(jī)制。雖然KN93更為明顯的抑制了CaMKⅡ向心肌細(xì)胞膜的聚集,但卻不能像Losartan那樣抑制CaMKⅡ與AT1受體之間的結(jié)合。
　　第

15、三部分，機(jī)械刺激后CaMKⅡ與AT1受體結(jié)合的部位
　　目的:研究在機(jī)械刺激下CaMKⅡ與AT1受體的可能結(jié)合部位。
　　方法:在硅膠皿培養(yǎng)的COS7細(xì)胞中單轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染野生型AT1受體質(zhì)粒與CaMKⅡ突變體質(zhì)粒,牽張刺激8分鐘后收集細(xì)胞總蛋白以Westem-blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染目的基因的蛋白表達(dá)效率和p-ERKs的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:Western-blot檢測(cè)提示轉(zhuǎn)染的目的基因AT1受體質(zhì)粒與CaMKⅡ突變體質(zhì)粒的

16、蛋白表達(dá)顯著,轉(zhuǎn)染效率可靠穩(wěn)定。牽張刺激之后,共轉(zhuǎn)染野生型AT1受體質(zhì)粒與CaMKⅡ的野生型、N端敲除突變體、C端敲除突變體質(zhì)粒的COS7細(xì)胞中p-ERKs表達(dá)均有顯著上調(diào),而轉(zhuǎn)染M段敲除突變體的COS7細(xì)胞牽張后的p-ERKs表達(dá)變化并不明顯,提示N、C端敲除對(duì)CaMKⅡ的功能無(wú)顯著影響,而M段對(duì)其促進(jìn)AT1受體結(jié)合的作用顯著。
　　結(jié)論:CaMKⅡ的中間自我抑制區(qū)域可能是其與AT1受體的結(jié)合部位。
　　第四部分，AT1受

17、體受機(jī)械刺激活化后引起心肌肥厚的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
　　目的:研究在AT1受體介導(dǎo)的細(xì)胞外機(jī)械刺激的心肌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin,CaN)的作用。
　　方法:8-10周齡的ATG-/-小鼠行如下處理:假手術(shù)+生理鹽水干預(yù)(n=8),TAC+生理鹽水干預(yù)(n=8),TAC+Losartan(3mg/Kg/d,n=8)干預(yù),TAC+FK506(1mg/Kg/d,n=8)干預(yù)。生理鹽水和干預(yù)藥物溶液均

18、通過(guò)術(shù)前3天埋植在小鼠背部皮下的滲透壓泵24小時(shí)持續(xù)給藥。TAC術(shù)后2周,所有小鼠在行經(jīng)胸心臟超聲測(cè)定心臟形態(tài)和心功能,侵入性心導(dǎo)管檢測(cè)主動(dòng)脈以及左室壓力后處死,取心臟測(cè)量心重并計(jì)算心重體重比值,部分心臟石蠟包埋后HE染色測(cè)定心肌細(xì)胞橫截面積,部分心臟直接用于抽提總蛋白和總RNA。Western-blot法檢測(cè)心肌細(xì)胞CaN表達(dá)水平。Realtime-PCR檢測(cè)肥厚相關(guān)基因ANP、SAA表達(dá)。
　　結(jié)果:TAC手術(shù)在ATG-/-小

19、鼠中成功構(gòu)建代償性心肌肥厚模型。FK506干預(yù)作用同Losartan干預(yù)作用相似,在并沒有明顯影響小鼠血流動(dòng)力學(xué)的情況下,明顯抑制了左心室前、后壁增厚,左室內(nèi)徑的減小和左心室射血分?jǐn)?shù)異常,對(duì)FS無(wú)明顯改變。同時(shí)也顯著降低了心重體重比、心肌細(xì)胞橫截面積和肥厚相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)。Losartan干預(yù)也有效抑制了心肌細(xì)胞CaN的表達(dá)。
　　結(jié)論:AT1受體介導(dǎo)了壓力超負(fù)荷誘發(fā)的心肌肥厚,并上調(diào)了細(xì)胞內(nèi)CaN表達(dá),后者是AT1受體介導(dǎo)的

20、細(xì)胞外機(jī)械信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的極為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。
　　結(jié)論：
　　1、機(jī)械刺激直接活化AT1受體需要CaMKⅡ的參與。
　　2、機(jī)械刺激引起心肌細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ向膜聚集并與AT1受體結(jié)合和相互作用,使得AT1受體可以直接被機(jī)械刺激活化,介導(dǎo)心肌肥厚作用。
　　3、CaMKⅡ的中間自我抑制區(qū)域可能是其與AT1受體的結(jié)合部位。
　　4、Losartan可以抑制CaMKⅡ與AT1受體之間的結(jié)合。
　　5、鈣

21、調(diào)神經(jīng)磷酸酶是AT1受體介導(dǎo)的機(jī)械刺激信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。
　　創(chuàng)新點(diǎn)和研究意義
　　1、本課題是針對(duì)機(jī)械刺激可以不依賴于AngⅡ直接激活A(yù)T1受體從而誘發(fā)心肌肥厚、損傷這一全新發(fā)現(xiàn)所做的深入機(jī)制研究。
　　2、揭示了機(jī)械刺激誘導(dǎo)CaMKⅡ和AT1受體的相互作用是導(dǎo)致AT1受體活化的重要機(jī)制。
　　3、發(fā)現(xiàn)了CaMKⅡ在機(jī)械刺激下向細(xì)胞膜的遷移定位現(xiàn)象,證實(shí)其并非只是單純的執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子作用。