β-,2-腎上腺素受體激動劑克侖特羅對新生大鼠心肌細胞的作用研究.pdf

1、β2腎上腺素受體激動劑克侖特羅對新生大鼠心肌細胞的作用研究 β腎上腺素受體(β-adrenergicreceptorβ-AR)，是典型的G蛋白偶聯(lián)受體，至少有3種亞型：β1-、β2-、β3-AR。腎上腺素受體介導的兒茶酚胺效應，在心血管功能調(diào)節(jié)中起著重要的作用。傳統(tǒng)認為，只有β1-AR才調(diào)節(jié)心臟功能。β1-AR與興奮型Gs蛋白偶聯(lián)，激活腺苷酸環(huán)化酶，促進胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)蓄積，從而引起正性變力效應，正性變時效應和正性變性

2、效應。近來發(fā)現(xiàn)，β1-和β2-AR共同調(diào)節(jié)心臟的功能。但近十年的研究表明，β1-AR僅與Gs偶聯(lián)，而β2-AR同時與Gs和Gi蛋白雙偶聯(lián)。無論生理還是病理狀況下，β2-AR/Gi偶聯(lián)都抑制了由β2-AR/Gs介導的正性肌力作用和正性舒張作用。因此，β1-和β2-AR在介導心臟功能方面存在差異。研究還發(fā)現(xiàn)，由于新生大鼠心肌細胞缺乏或很少有β2-AR/Gi偶聯(lián)，β2-AR介導的新生大鼠心臟的生物效應與成年大鼠也有所不同。由于種屬、細胞、以及

3、動物年齡等的差異，目前關于β2-AR對心肌細胞作用的報道也結論不一。本學位論文就β2-AR激動劑克侖特羅(clenbuterol)在新生大鼠心肌細胞介導的生物效應進行了研究，由三部分組成：(1)β2-AR激動劑克侖特羅對新生大鼠心肌細胞受磷蛋白磷酸化的作用；(2)β2-AR激動劑克侖特羅對心肌細胞MAPK信號通路的作用及機制研究；(3)β2-AR激動劑克侖特羅對心肌細胞—氧化氮合成的作用。 第一部分 克侖特羅對新生大鼠心

4、肌細胞受磷蛋白磷酸化的作用 背景：心肌β-AR被兒茶酚胺激活后可以增加心肌收縮并加快心肌舒張。在成年大鼠心肌細胞β2AR激活后可通過cAMP-PKA信號途徑促L型鈣通道開放，但對受磷蛋白(phospholamban，PLB)磷酸化沒有影響。推測在新生大鼠心肌細胞β2AR對PLB的磷酸化作用有可能不同于成年大鼠心肌細胞。 方法：測定給予克侖特羅后心肌細胞搏動頻率和胞內(nèi)cAMP水平變化的時間曲線。采用Westernblo方法

5、，檢測受磷蛋白在Serine16(Ser16)和Threonine17(Thr17)的磷酸化水平。 結果：克侖特羅以時間依賴性方式增加新生大鼠心肌細胞搏動頻率以及細胞內(nèi)cAMP水平。克侖特羅還可以時間-劑量依賴性的方式促進受磷蛋白在Ser16位點的磷酸化，該作用可被選擇性β2AR阻斷劑ICI118551和PKA抑制劑Rp-cAMP所阻斷。Gi蛋白抑制劑PTX具有協(xié)同作用，但不顯著。Clenbuterol還可促進受磷蛋白在Thr1

6、7位點的磷酸化，并呈時間依賴性。 結論：在新生大鼠心肌細胞β2克侖特羅可促進受磷蛋白在Ser16和Thr17位點的磷酸化，可能參與改善心臟舒張功能。 第二部分 克侖特羅對新生大鼠心肌細胞MAPK信號通路的作用及機制研究 §1克侖特羅對新生大鼠心肌細胞ERK1/2的作用及機制研究 背景：G蛋白偶聯(lián)受體可通過Gi蛋白激活胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignal-regulatedk

7、inase1/2，ERK1/2)。在不同細胞胞內(nèi)cAMP積聚可增加或減少ERK1/2的活性。鈣動員也參與ERK1/2的磷酸化和去磷酸化的調(diào)節(jié)。在成年大鼠心肌細胞β2AR可通過Gi蛋白信號途徑磷酸化ERK1/2。而β2AR可促進新生大鼠心肌細胞鈣動員和cAMP水平增加但對成年大鼠心肌細胞無作用。故推測β2AR在新生大鼠心肌細胞對ERK1/2磷酸化的作用不同于成年大鼠心肌細胞。本實驗擬觀察β2AR對新生大鼠心肌細胞ERK1/2的磷酸化作用并

8、闡明其機制。 方法：采用Westernblot方法，檢測經(jīng)與β2AR信號通路有關的試劑處理的培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞磷酸化ERK1/2蛋白和ERK2總蛋白表達水平。 結果：Clenbuterol對新生大鼠心肌細胞的ERK1/2磷酸化具有雙相作用，表現(xiàn)為給藥后磷酸化水平迅速升高，2min達到最高值，既而下降，在給藥后30min降至基礎水平的60％。Clenbuterol對ERK1/2的磷酸化和去磷酸化的作用均呈劑量依賴性。細胞

9、外鈣有無對clenbuterol的促磷酸化作用無影響，但蘭諾丁受體(ryanodinereceptor)激動劑ryanodine對此具有協(xié)同作用。而選擇性β2AR激動劑ICI118551，百日咳毒素(pertussistoxin，PTX)，鈣螯合劑BAPTA-AM和蘭諾丁受體阻斷劑retheniumred可顯著抑制clenbuterol的促磷酸化作用，而鈣拮抗藥硝苯地平nifedepine的抑制作用不明顯。相反，蛋白磷酸酶抑制劑okad

10、aicacid和鈣泵ATP酶抑制劑thapsigargin均可翻轉clenbuterol的去磷酸化作用。蛋白激酶A抑制劑Rp-cAMP也可抑制clenbuterol的去磷酸化作用。Caffeine亦對ERK1/2具有磷酸化和去磷酸化的雙相作用，thapsigargin可阻斷caffeine的去磷酸化作用，而okadaicacid對之無影響。Caffeine和clenbuterol一樣可持續(xù)激活PLB。 結論：β2受體激活后對新生

11、大鼠心肌細胞ERK1/2磷酸化具有雙相作用，其中胞內(nèi)鈣動員扮演重要角色。Clenbuterol激活ERK1/2與Gi蛋白信號途徑和鈣庫釋放Ca2+有關，而clenbuterol對ERK1/2的去磷酸化作用則可能與受磷蛋白磷酸化后加快鈣庫攝取Ca2+有關。 §2克侖特羅對新生大鼠心肌細胞p38MAPK的作用及機制研究 背景：文獻報道p38MAPK可誘導新生大鼠心肌細胞凋亡，而在成年大鼠心肌細胞βAR/Gi通路激活的p38M

12、APK對βAR/Gs信號通路誘導的細胞凋亡具有保護作用。本論文前部分研究表明clenbuterol通過Gs和Gi蛋白偶聯(lián)對新生大鼠心肌細胞ERK1/2磷酸化具有雙相作用，而在成年大鼠心肌細胞僅通過Gi蛋白偶聯(lián)促進ERK1/2磷酸化。因此推測clenbuterol對新生大鼠心肌細胞p38MAPK磷酸化的作用不同于成年大鼠心肌細胞。 方法：采用Westernblot方法，檢測經(jīng)各種試劑處理后的培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞磷酸化p38MAPK

13、和總p38MAPK蛋白表達水平。 結果：Clenbuterol可激活p38MAPK，該作用呈時間和劑量依賴性，并能被選擇性β2AR阻斷劑ICI118551所抑制；Gi蛋白抑制劑PTX對clenbuterol誘導的p38MAPK磷酸化具有協(xié)同作用，而蛋白激酶A抑制劑Pp-cAMP可阻斷之；鈣通道阻滯藥nifedipine和Ca2+螯合劑BAPTA-AM均可阻斷clenbuterol對p38MAPK的促磷酸化作用。 結論：在

14、新生大鼠心肌細胞β2AR激活后可通過Gs/cAMP信號途徑促進p38MAPK磷酸化，該作用和細胞外鈣內(nèi)流增加細胞內(nèi)鈣濃度有關。 第三部分 克侖特羅對新生大鼠心肌細胞一氧化氮合成的作用 背景：一氧化氮(NitricOxide，NO)是調(diào)節(jié)心血管、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)功能的重要信號分子。NO具有舒張血管，對各種細胞的細胞毒性和細胞保護作用等多種生物學效應。血管平滑肌細胞、心肌細胞在受到內(nèi)毒素和某些細胞因子刺激后誘生型一氧化

15、氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)表達增加并釋放大量NO。研究表明，在患有擴張型心肌病、缺血性心肌病和其他心血管疾病的患者發(fā)生心力衰竭時，iNOS基因表達通常會增加。 在新生大鼠心肌細胞，cAMP可增加細胞因子介導的NO合成。喂食β2AR激動劑clenbuterol可誘導大鼠血管平滑肌細胞合成NO。而本論文第一部分研究表明，clenbuterol可顯著增加新生大鼠心肌細胞胞內(nèi)cAMP水平

16、。在本實驗中，擬觀察clenbuterol對培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞的NO合成的影響。 方法：采用Griess試劑檢測新生大鼠心肌細胞培養(yǎng)液中NO的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽nitrite的含量，間接反映NO含量。采用Westernblot方法，檢測培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞iNOS蛋白表達水平。 結果：單獨給予clenbuterol對于NO合成無任何影響，但能使IL-1β誘導心肌細胞產(chǎn)生的NO顯著增加，此協(xié)同作用呈時間-劑量依賴性。