甘草次酸與β2腎上腺素受體激動(dòng)劑協(xié)同增效作用的分子機(jī)理研究.pdf

1、哮喘是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅公眾健康的一種重要疾病，目前約有1億以上的患者。近年來雖然有關(guān)哮喘的病理學(xué)、分子免疫學(xué)和分子藥理學(xué)的研究進(jìn)展較快，世界各國對于哮喘病的基礎(chǔ)與臨床研究均有較大的突破，但流行病學(xué)的調(diào)查顯示，有關(guān)成人哮喘和兒童哮喘的發(fā)病率和死亡率并沒有降低，反而有逐年增加的趨勢。鑒于哮喘炎癥網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，人們意識到針對單一的靶標(biāo)并不能有效地治療氣管炎癥，而直接針對主要功能節(jié)點(diǎn)和通路的干預(yù)又會引起較強(qiáng)的毒副作用。中醫(yī)治療咳喘有獨(dú)特的理論

2、基礎(chǔ)，而引入中醫(yī)的治療理念，針對復(fù)方中藥多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑、多組分配伍的用藥特點(diǎn)，更能體現(xiàn)祛邪與扶正，治標(biāo)與治本，協(xié)同與拮抗的辯證施治的原則。東西方醫(yī)學(xué)體系及藥物研發(fā)體系的融合，可能是解決各自發(fā)展中面臨的挑戰(zhàn)和瓶頸問題的一條重要途徑。
　　 甘草作為應(yīng)用歷史最廣的代表藥材之一，具有中和之性，調(diào)和諸藥之功。甘草的主要活性成分為甘草酸，而甘草酸在體內(nèi)迅速被代謝為甘草次酸。本論文以甘草酸與β2腎上腺素受體(β2 adrenergi

3、c receptor，β2AR)激動(dòng)劑的協(xié)同作用的分子機(jī)理研究為切入點(diǎn)，首先采用TNF-α誘導(dǎo)的人支氣管平滑肌細(xì)胞的炎癥模型，利用基因芯片技術(shù)考察了甘草酸和麻黃堿等藥物干預(yù)前后細(xì)胞內(nèi)35800個(gè)基因的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)甘草酸介導(dǎo)的基因表達(dá)的變化主要集中在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體磷酸化調(diào)節(jié)、離子通道、細(xì)胞凋亡等方面，為系統(tǒng)全面的了解β2AR激動(dòng)劑和甘草酸的協(xié)同作用機(jī)制提供了線索。
　　 本文構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)血球凝集素(hemagglutinin

4、epitope，HA)表位標(biāo)簽的β2AR細(xì)胞系——β2AR-HA-HEK293細(xì)胞系，通過HA標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)了對β2AR的定位追蹤及含量變化分析。結(jié)果表明，0.1mM甘草酸和甘草次酸均可以有效的抑制0.1mMβ2AR激動(dòng)劑沙丁胺醇引起的β2AR在胞漿內(nèi)形成的顆粒聚集；同時(shí)，β2AR與Gαs的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘草次酸可以有效的提高β2AR和Gαs的偶聯(lián)效率，降低β2AR的磷酸化的程度，阻斷β-arrestins以及籠型蛋白(clathr

5、in)和β2AR的結(jié)合，抑制衣被小窩的形成，抑制β2AR的內(nèi)化，最終穩(wěn)定了細(xì)胞膜表面β2AR的數(shù)量，保護(hù)了受體的功能。該結(jié)果為甘草酸或甘草次酸治療或緩解β2AR激動(dòng)劑引起的受體脫敏提供了理論依據(jù)。
　　 采用螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferases，F(xiàn)L)與海腎熒光素酶(Renilla luciferases，RL)作為雙報(bào)告基因，本論文構(gòu)建了一種基于雙熒光素酶報(bào)告基因的β2AR激動(dòng)劑活性評價(jià)系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)檢測細(xì)

6、胞內(nèi)cAMP水平變化，重點(diǎn)分析了甘草次酸對β2AR、G蛋白(Gprotein)和腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)三個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體(Gproteincouplereceptor，GPCR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中關(guān)鍵分子的協(xié)同作用。結(jié)果表明，甘草次酸對β2AR激動(dòng)劑異丙腎上腺素，G蛋白激動(dòng)劑GppNHp，AC激動(dòng)劑Forskolin具有不同程度的協(xié)同增效作用，但不能逆轉(zhuǎn)特異性β2AR拮抗劑ICI118，551對β2AR的拮

7、抗作用，證明β2AR的激活是必不可少的前提條件，因此推測甘草次酸的協(xié)同作用與β2AR的激活有直接的關(guān)系，從一定程度上解釋了甘草在咳喘中藥中配伍的科學(xué)內(nèi)涵。
　　 為了揭示甘草次酸的作用靶點(diǎn)，本論文成功的合成了可以用于熒光標(biāo)記的甘草次酸疊氮化衍生物(azide-terminal glycyrrhetic acid，ATGA)，以及生物素炔基衍生物(biotin-LC-alkyne)和4-ethynyl-N-ethyl-1，8-na

8、phthalimide熒光探針。通過點(diǎn)擊化學(xué)的熒光示蹤技術(shù)，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡的觀察，實(shí)時(shí)監(jiān)測了甘草次酸衍生物的細(xì)胞定位和分布情況。結(jié)果顯示，脂筏區(qū)標(biāo)志性GM1蛋白和ATGA共同處于細(xì)胞膜的脂筏區(qū)，而甘草次酸會競爭性的降低ATGA在細(xì)胞膜脂筏區(qū)的分布。另外，ATGA與β2AR的共定位程度較低，表明了兩者分布在細(xì)胞膜上不同的區(qū)域。
　　 采用蔗糖密度梯度離心技術(shù)分離對各組分中膽固醇含量測量的結(jié)果表明，細(xì)胞膜中的膽固醇主要集中在脂

9、筏區(qū)域；但在甘草次酸的作用下，脂筏區(qū)域的膽固醇含量明顯的下降，而在相應(yīng)的脂筏區(qū)中的甘草次酸標(biāo)記物ATGA的含量增加，推測甘草次酸可能具有競爭性降低脂筏區(qū)中膽固醇含量的作用。此外，加入外源性的膽固醇可以有效的抑制了甘草次酸的協(xié)同增強(qiáng)的作用，從另一個(gè)角度也證明了甘草次酸和膽固醇的相互作用是協(xié)同增效作用的關(guān)鍵。膜流動(dòng)性分析的ESR結(jié)果表明，0.1mM甘草次酸處理后的細(xì)胞膜序參數(shù)(S)沒有顯著性的變化，說明細(xì)胞膜淺層的流動(dòng)性沒有受到顯著影響；相

10、反在甘草次酸處理后，旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間tc為15.13±0.15 s，和對照組細(xì)胞16.03±0.11 s相比明顯降低(p＜0.05)，說明細(xì)胞膜深層流動(dòng)性明顯增加；而S/W值從處理前的5.31±0.09降低為4.67±0.11，表明細(xì)胞膜蛋白構(gòu)象發(fā)生了變化，表明蛋白分子在甘草次酸的作用下變得更加緊湊。
　　 應(yīng)用離子去污劑法（Triton X-100法）和非離子去污劑法(Na2CO3法)兩種脂筏分離方法，研究了甘草次酸對β2AR信號

11、通路中的相關(guān)信號分子在脂筏區(qū)域分布的影響。在非離子去污劑分離法中，甘草次酸可以使激活型的G蛋白的alpha亞基(Gαs)移出脂筏區(qū)域并移位到了非脂筏區(qū)域；在離子去污劑分離法中，甘草次酸也使得位于脂筏區(qū)的Gαs亞基和ACⅤ/Ⅵ轉(zhuǎn)移到了非脂筏區(qū)域。上述結(jié)果均闡明了甘草次酸具有解除脂筏對Gαs等信號分子限制的能力。
　　 綜上所述，甘草次酸可以與膽固醇競爭性的結(jié)合在細(xì)胞膜的脂筏區(qū)，通過降低細(xì)胞膜膽固醇的密度，增加細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的流動(dòng)性，改

12、變了其中信號分子蛋白的構(gòu)象，削減了脂筏對β2AR信號通路信號分子的限制，使得Gαs蛋白從脂筏區(qū)中游離出來，增加了β2AR和Gαs的偶聯(lián)，使得β2AR由非活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變成活化狀態(tài)。由于處于活化狀態(tài)的β2AR數(shù)量增加，當(dāng)β2AR激動(dòng)劑加入時(shí)導(dǎo)致cAMP的產(chǎn)量增加，因此信號的級聯(lián)放大的效率增加。此研究結(jié)果揭示了甘草次酸與β2AR激動(dòng)劑的協(xié)同增效的科學(xué)內(nèi)涵。
　　 文獻(xiàn)研究已經(jīng)證明，大量的細(xì)胞受體和脂類信號分子被募集在脂筏中，而脂筏主要通