T-cadherin受體在脂聯(lián)素抑制缺氧-復(fù)氧導(dǎo)致的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、第一部分:乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)以及腺病毒介導(dǎo)干擾RNA的轉(zhuǎn)染
　　 目的:原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，確定腺病毒介導(dǎo)的干擾RNA體外轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞的最佳MOI值。
　　 方法:
　　 (1)乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)
　　 取剛出生72小時(shí)內(nèi)的SD乳鼠，消毒，開(kāi)胸，取左心室部分，冰浴的D-hanks液中洗滌，剪碎。膠原酶Ⅱ消化3-5次，離心，收集細(xì)胞，20％血清的培養(yǎng)液混懸，差速貼壁90分鐘，收集培養(yǎng)液中的非貼壁細(xì)

2、胞，種于6孔板，48小時(shí)更換培養(yǎng)基，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和自發(fā)搏動(dòng)情況。
　　 (2)心肌細(xì)胞的鑒定:針對(duì)胞漿中α-actin和肌鈣蛋白cTnT，分別采用免疫熒光法和免疫組織化學(xué)法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　 (3)Ad-siRNA體外靶向性轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞最佳滴度檢測(cè)
　　 體外原代培養(yǎng)乳鼠的心肌細(xì)胞，將腺病毒介導(dǎo)的干擾RNA按不同的MOI值進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過(guò)倒置熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀確定此腺病毒體外轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞

3、的最佳MOI值，并確定其安全性和感染力。
　　 結(jié)果:
　　 (1)倒置顯微鏡下觀察:原代培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)后可貼壁，48小時(shí)后出現(xiàn)自發(fā)博動(dòng)，72小時(shí)后細(xì)胞間形成細(xì)胞連接，成簇生長(zhǎng)。
　　 (2)經(jīng)免疫熒光法和免疫組織化學(xué)法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為心肌細(xì)胞，且純度可達(dá)95％以上。
　　 (3)倒置熒光顯微鏡以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腺病毒的轉(zhuǎn)染效率:轉(zhuǎn)染后72h，MOI值為100時(shí)，腺病毒的紅色熒光表達(dá)最強(qiáng)，感染效率高于9

4、0％。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功培養(yǎng)了乳鼠心肌細(xì)胞，并且確定了腺病毒介導(dǎo)的siRNA在體外安全有效的轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞的佳MOI值。
　　 第二部分:APN/T-cadher in在缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致乳鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用
　　 目的:建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)模型，同時(shí)使用腺病毒介導(dǎo)的干擾RNA技術(shù)體外沉默脂聯(lián)素受體T-cadherin的表達(dá)，觀察APN/T-cadherin對(duì)缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞凋亡的影響。

5、
　　 方法:選用原代培養(yǎng)72小時(shí)的單層心肌細(xì)胞隨機(jī)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為5組:①空白對(duì)照組:心肌細(xì)胞正常培養(yǎng);②缺氧/復(fù)氧組;③脂聯(lián)素+缺氧/復(fù)氧組④脂聯(lián)素+缺氧/復(fù)氧+ Ad-T-cadherin-siRNA組;⑤缺氧/復(fù)氧+脂聯(lián)素+Ad-siRNA（腺病毒陰性對(duì)照）組。倒置熒光顯微鏡下觀察各組心肌細(xì)胞的形態(tài)以及自發(fā)搏動(dòng)情況;在MOI值為100，轉(zhuǎn)染72h后，用Real Time-PCR和Western blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞

6、T-cadherin的表達(dá)的情況;流式細(xì)胞術(shù)，脫氧核糖核菅酸缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞的凋亡。
　　 結(jié)果:(1)各組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較:H/R組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差，細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)率減弱。而H/R+APN組，多數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近正常，細(xì)胞搏動(dòng)較快。H/R+APN+Ad-T-cadherin-siRNA組，多數(shù)細(xì)胞狀態(tài)差，自發(fā)搏動(dòng)較H/R+APN組明顯減慢。H/R+APN+Ad-HK組，細(xì)胞狀態(tài)良好。
　　 (2)

7、 RT-PCR和Western blot印跡分析的結(jié)果顯示:各組均可以檢測(cè)到T-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)，其中與正常組比較，H/R組T-cadherin的表達(dá)明顯降低，差異顯著(P＜0.05)。給予脂聯(lián)素預(yù)處理后，T-cadherin的表達(dá)明顯增高，與H/R組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。APN+H/R+Ad-T-cad-siRNA組T-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)也明顯降低，與APN+H/R組比較，差異顯

8、著(P＜0.05)。
　　 (3)流式以及TUNEL結(jié)果均顯示:與正常組比較，H/R組細(xì)胞的凋亡明顯增多，差異顯著(P＜0.05)。給予脂聯(lián)素預(yù)處理后，心肌細(xì)胞的凋亡比較與單純的H/R組，凋亡明顯降低(P＜0.05)。與H/R十APN組相比，APN+H/R+Ad-T-cad-siRNA組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而與單純H/R組相比，凋亡率差異不明顯(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:(1).