脂聯(lián)素對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的影響及其機(jī)制的探討.pdf

1、目的：通過(guò)培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心室肌細(xì)胞，建立缺氧/復(fù)氧模型，以模擬在體心肌缺血/再灌注損傷，觀察脂聯(lián)素對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。 方法： 采用胰蛋白酶消化法，結(jié)合差速貼壁法和化學(xué)試劑抑制法分離純化1～3天SD大鼠心室肌細(xì)胞，分離的心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和自發(fā)搏動(dòng)情況，并通過(guò)α-肌動(dòng)蛋白和心肌特異性肌鈣蛋白cTnT免疫熒光法對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞

2、進(jìn)行鑒定。 選用培養(yǎng)72小時(shí)的單層心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為6組：①空白對(duì)照組：心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)；②脂聯(lián)素組(APN組)：加入終濃度為30μg/ml的脂聯(lián)素與心肌細(xì)胞共孵育24小時(shí)；③缺氧/復(fù)氧組(H/R組)：用缺氧液置換正常細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板置于純氮持續(xù)通氣的密閉容器中(37℃)3小時(shí)造成缺氧，再用復(fù)氧液置換缺氧液，以純氧孵育1小時(shí)(37℃)造成再?gòu)?fù)氧；④缺氧/復(fù)氧+脂聯(lián)素組(H/R+APN組)：終濃度為30μg/ml的脂聯(lián)

3、素與心肌細(xì)胞孵育24h后，進(jìn)行缺氧/復(fù)氧干預(yù)；⑤缺氧/復(fù)氧+脂聯(lián)素+AraA組(H/R+APN+AraA組)：加入終濃度分別為30μg/ml脂聯(lián)素和1 mmol/L AraA與心肌細(xì)胞孵育24h后，進(jìn)行缺氧/復(fù)氧干預(yù)；⑥缺氧/復(fù)氧十AraA組(H/R+AraA組)：加入終濃度為1 mmol/L，的AraA，心肌細(xì)胞預(yù)處理24h后，進(jìn)行缺氧/復(fù)氧干預(yù)。實(shí)驗(yàn)終止后，在倒置相差顯微鏡下觀察各組心肌細(xì)胞形態(tài)及自發(fā)搏動(dòng)情況，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)

4、構(gòu)，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)采用硫代巴比妥比色法與黃嘌呤氧化酶法分別測(cè)定細(xì)胞丙二醛(MDA)含量及培養(yǎng)液中超氧化物歧化酶(SOD)活性。 結(jié)果： 1.細(xì)胞鑒定：倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞成簇生長(zhǎng)，有規(guī)律的自發(fā)性搏動(dòng)，頻率約90～120次/分。熒光倒置顯微鏡下可見(jiàn)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光，即胞漿內(nèi)表達(dá)a.肌動(dòng)蛋白與肌鈣蛋白cTnT，符合心肌細(xì)胞的特征。 2.各組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較：H/R組細(xì)胞

5、生長(zhǎng)狀態(tài)較差，電鏡下可見(jiàn)染色質(zhì)邊集、凋亡小體等凋亡特征性改變，細(xì)胞搏動(dòng)頻率較空白組明顯降低(19.50±3.39 vs 99.83±4.22beat/min，p<0.05)；而H/R十APN組(94.33±3.93 beat/rain)多數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近正常，少數(shù)有染色質(zhì)輕度邊集、核深染等形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞搏動(dòng)頻率較快，與H/R組相比有顯著性差異(p<0.05)；H/R+APN+AraA組搏動(dòng)頻率較H/R+APN組明顯減慢，有顯著性差異(p

6、<0.05)。H/R+AraA組搏動(dòng)頻率為7.36±2.79 beat/min，與H/R組差異顯著(p<0.05)。APN組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，搏動(dòng)頻率與空白組相比有顯著差異(122.09±3.67 vs 99.83±4.22beat/min，p<0.05)。 3.瓊脂糖凝膠電泳細(xì)胞DNA結(jié)果分析：空白組與APN組DNA電泳呈一條大分子DNA片斷，為正常基因組DNA帶形：H/R組DNA則表現(xiàn)為明顯的非隨機(jī)降解狀態(tài)，在電泳中呈特征分布，

7、即凋亡獨(dú)有的“梯狀圖譜”；H/R+APN組DNA梯狀條帶消失，接近正?；蚪MDNA帶形：H/R+APN+AraA組與H/R+AraA組亦表現(xiàn)為梯狀條帶。 4.各組心肌細(xì)胞凋亡百分率的比較：H/R組的DNA直方圖表現(xiàn)為在G0/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)DNA含量減少的亞二倍體峰(又稱細(xì)胞凋亡峰)，細(xì)胞凋亡率較空白組明顯增高(48.43±4.18％vs 2.30±0.89％，p<0.05)；而H/R+APN組凋亡率與H/R組相比明顯降低，有顯

8、著性差異(10.93±2.47％ vs 48.43±4.18％，p<0.05)；H/R+APN+AraA組細(xì)胞凋亡率為53.32±1.56％，與H/R+APN組差異顯著(p<0.05)；H/R+AraA組細(xì)胞凋亡率達(dá)69.89±0. 72％，與H/R組有顯著性差異(p<0.05)。APN組凋亡率較空白組明顯降低，有顯著性差異(1.06±0.46％ vs 2.30±0.89％，p<0.05)。 5.各組細(xì)胞MDA含量及培養(yǎng)液中SO

9、D活性的比較：H/R組MDA較空白組明顯升高(2.94±0.78 vs 0.90±0.12nmol/L，p<0.05)，而SOD活性顯著下降(28.30±19.87 vs 58.63±22.03 NU/ml，p<0.05)；H/R+APN組MDA為1.23±0.51nmol/L，SOD為51.45±22.34NU/ml，均與H/R組有顯著差異(p<0.05)。APN組與空白組比較無(wú)明顯差異(p>0.05)。 結(jié)論： 1.