ARC及IGF-1在AS肉雞中抗心肌細(xì)胞凋亡作用的研究.pdf

1、肉雞腹水綜合征(Ascites Syndrome，AS)是一種非傳染性疾病，臨床上以顯著的腹腔積水、右心室肥大/衰竭、肺充血、水腫以及肝淤血為主要特征。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)AS的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了大量的研究，但仍未找到良好的防制方法。
　　 目前國(guó)內(nèi)外對(duì)ARC在心臟疾病中的研究主要是針對(duì)哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞，而且普遍認(rèn)為ARC對(duì)哺乳動(dòng)物心肌氧化損傷、梗死、肥大均具有良好的保護(hù)作用。肉雞腹水征發(fā)病過程中，心肌細(xì)胞明顯肥大并伴有嚴(yán)重?fù)p傷，然而關(guān)

2、于ARC對(duì)肉雞心肌肥大＼損傷的保護(hù)及調(diào)控機(jī)制研究尚未見報(bào)道。為了從分子、細(xì)胞和整體的方面，探討ARC在心肌細(xì)胞肥大、凋亡及腹水形成方面的抑制作用，揭示ARC蛋白與caspases-2、caspases-8、BAX和BCL-2的聯(lián)系，闡明ARC對(duì)腹水肉雞心肌細(xì)胞肥大、調(diào)亡和腹水形成的分子調(diào)控機(jī)制，進(jìn)行了相關(guān)的研究。
　　 1.肉雞腹水綜合征模型建立及血液生化指標(biāo)測(cè)定
　　 傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為腹水綜合征肉雞死于肺動(dòng)脈高壓誘導(dǎo)的右

3、心衰竭，然而其確切的導(dǎo)致右心衰竭的機(jī)制卻不明了?，F(xiàn)在有文獻(xiàn)表明，活性氧具有損傷心肌細(xì)胞的能力，且是導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的主要因素之一。本實(shí)驗(yàn)將重點(diǎn)檢測(cè)肉雞腹水發(fā)生時(shí)，血清及血漿中活性氧的含量變化以及這種變化對(duì)心肌組織的影響。運(yùn)用低溫、缺氧、高能量的方法誘導(dǎo)肉雞腹水(快速生長(zhǎng)組)，來建立肉雞腹水發(fā)病模型，以低能量組作為對(duì)照(低速生長(zhǎng)組)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和單純的高能量及低溫誘導(dǎo)相比，缺氧是更為有效的誘導(dǎo)腹水發(fā)生的手段，且檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示在快速生長(zhǎng)組

4、中活性氧的水平和低速生長(zhǎng)組相比顯著上升。此外，在快速生長(zhǎng)組的心肌組織凋亡水平檢測(cè)方面，發(fā)現(xiàn)了高水平的心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，這種顯著的活性氧含量變化可能是導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的主要原因。
　　 2.ARC基因克隆與原核表達(dá)
　　 以小鼠心臟組織提取的總RNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出小鼠的ARC全長(zhǎng)cDNA，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物重組到PMD-18T載體中，測(cè)得全基因的核苷酸序列。序列分析表明，小鼠ARC全長(zhǎng)cD

5、NA為663bp，編碼221個(gè)氨基酸，于GenBank中的NM_030152.4的序列完全相同。運(yùn)用PCR及雙酶切技術(shù)把目的基因克隆到pESATTM-E1表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，成功表達(dá)出小鼠ARC融合蛋白。
　　 3.原代雞胚心肌細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定及活性測(cè)定
　　 如何獲得高活力的心肌細(xì)胞，是研究肉雞心肌細(xì)胞凋亡的重要基礎(chǔ)。經(jīng)過多年的研究積累，大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法已經(jīng)幾近成熟，但雞的心肌

6、細(xì)胞培養(yǎng)方法卻鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)比運(yùn)用組織塊貼壁和膠原酶消化法，處理11日齡的AA艾維茵雞胚，獲得雞胚心肌細(xì)胞。通過形態(tài)觀察，運(yùn)用MTT法，檢測(cè)分離純化后及生長(zhǎng)期的心肌細(xì)胞活性。發(fā)現(xiàn)兩種方法都可獲得足量的心肌細(xì)胞，但膠原酶消化法得到的細(xì)胞活力，更適合做為基礎(chǔ)研究的細(xì)胞模型。
　　 4.IGF-1與ARC作用關(guān)系研究
　　 研究顯示胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)和ARC蛋白在調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡方面有著顯著的作用。盡管目前它們

7、如何調(diào)控抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制并為被全面認(rèn)知，但在心肌細(xì)胞中同樣的抗凋亡功能，預(yù)示著它們之間存在著某些關(guān)聯(lián)。我們的研究發(fā)現(xiàn)雙氧水可以誘導(dǎo)降低ARC蛋白的表達(dá)水平，而IGF-1卻能改變這種趨勢(shì)。為了深入研究這種關(guān)聯(lián)效應(yīng)，運(yùn)用免疫熒光和免疫印跡的方法，分析得出LY294002(PI3K抑制劑)能阻斷IGF-1對(duì)ARC蛋白的調(diào)控作用以及它對(duì)在雙氧水存在下的心肌細(xì)胞抵抗凋亡能力。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在雙氧水誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的模型中，IGF-1對(duì)心肌

8、細(xì)胞的保護(hù)能力是通過PI3K途徑來實(shí)現(xiàn)的。
　　 5.鼠源性的ARC蛋白在雞胚心肌細(xì)胞中抗凋亡作用研究
　　 抗凋亡蛋白ARC和氧化應(yīng)激及缺氧再灌注引起的損傷有密切關(guān)系。盡管具體的聯(lián)系機(jī)制仍未被充分認(rèn)識(shí)，但許多的研究表明外源性的ARC蛋白也具有抗凋亡能力。本研究重點(diǎn)探討鼠源性的ARC蛋白在雞胚心肌細(xì)胞中是否有抗凋亡能力以及其調(diào)控途徑。為了研究鼠源性的ARC蛋白在過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡模型是否有抗凋亡能力，我們構(gòu)建了重

9、組pcDNA3.1/ARC質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)染到雞胚心肌細(xì)胞中。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡的方法檢測(cè)ARC相關(guān)的基因(caspases-2，-8，-3，and-9，and cytochrome c，bcl-2，and XIAP)的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡能被轉(zhuǎn)染的鼠源性的ARC蛋白所抑制。此外，外源性的ARC主要集中表達(dá)在心肌細(xì)胞的胞質(zhì)，并且能顯著下調(diào)caspases-2，-8，-3，bcl-2，XIA