心肌細(xì)胞凋亡在機(jī)械創(chuàng)傷致繼發(fā)性心臟損傷中的作用及其可能機(jī)制.pdf

1、研究背景
　　 機(jī)械性外傷是一個(gè)主要的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題，是一種臨床常見(jiàn)的損傷。機(jī)械性外傷可以引起出血性休克、組織損傷和循環(huán)因子的釋放，并且在傷者初步穩(wěn)定后仍可能繼續(xù)威脅生命。雖然臨床和實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)，損傷后器官功能衰竭是損傷晚期死亡的最主要原因，但繼發(fā)性組織損傷的機(jī)理在很大程度上尚不明了。因此，鑒定外傷后器官損傷，探討相應(yīng)器官功能失調(diào)機(jī)理以尋求相應(yīng)的治療方案，從而減少一切與外傷相關(guān)的繼發(fā)性器官損傷是非常關(guān)鍵的。
　　 隨

2、著院前急救體系的建立和完善，原發(fā)性機(jī)械損傷已得到有效控制，但繼發(fā)性損傷，因其容易漏診，而成為威脅創(chuàng)傷患者的潛在殺手。臨床研究表明，一些機(jī)械創(chuàng)傷患者在入院觀察24h內(nèi)未發(fā)現(xiàn)直接的心臟損傷，卻在創(chuàng)傷后數(shù)天或數(shù)周出現(xiàn)了心肌梗死。但是，機(jī)械性創(chuàng)傷導(dǎo)致的這種繼發(fā)性心臟損傷的具體機(jī)制尚不清楚。到目前為止，缺乏理想的動(dòng)物模型，是制約其深入研究的主要瓶頸之一。
　　 我們?cè)谇捌谘芯恐?，選用Noble-Collip鼓制備了一種能夠模擬臨床繼發(fā)心臟

3、損傷的機(jī)械創(chuàng)傷模型，發(fā)現(xiàn)以40轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)5min時(shí)，創(chuàng)傷大鼠在24h內(nèi)心電圖、平均動(dòng)脈壓及在體心功能均未發(fā)生明顯改變，但是創(chuàng)傷24h時(shí)離體心臟收縮、舒張功能均顯著降低。提示這種創(chuàng)傷模型可能引起繼發(fā)性心肌損傷，只是在機(jī)體神經(jīng)-體液因素的調(diào)節(jié)下，仍然能夠維持正常功能。但是，這種心肌損傷的病理生理學(xué)意義仍然需要進(jìn)一步的探究。第一，這種模型是能夠直接引起創(chuàng)傷后的繼發(fā)性心臟損傷，還是能夠?qū)е滦呐K組織對(duì)不良刺激的敏感性增高并不清楚。其次，

4、導(dǎo)致這種心肌損傷的機(jī)制是什么也不清楚。
　　 研究表明，機(jī)械創(chuàng)傷時(shí)大量產(chǎn)生的自由基（包括活性氧，一氧化氮）和炎性因子，是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要原因。而后者的主要形式有壞死和凋亡兩種，一定數(shù)量的心肌細(xì)胞丟失將導(dǎo)致心臟功能障礙。探討外傷后心肌細(xì)胞丟失的機(jī)制將有利于尋找阻止外傷后心肌損傷的最佳治療方案，并引申到外傷后其他器官損傷的防治。本研究將采用離體、在體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃退幚韺W(xué)抑制劑等方法，探尋外傷后心肌細(xì)胞丟失的可能機(jī)制，從而為尋找防止創(chuàng)傷

5、后多器官功能衰竭的最佳治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分
　　 目的
　　 觀察Noble-Collip鼓制備的機(jī)械創(chuàng)傷模型是否會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性心肌損傷，從而為揭示繼發(fā)性心臟損傷的可能機(jī)制提供研究條件，并奠定研究基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 1.機(jī)械創(chuàng)傷模型的制備按照我們前期的研究選取體重約180g-220g的健康雄性SD大鼠，將其麻醉后放入直徑約30.5cm的Noble-Collip鼓中，以40轉(zhuǎn)/mi

6、n的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)5min，大鼠每轉(zhuǎn)動(dòng)一圈跌落一次，偽創(chuàng)傷組大鼠用膠帶黏貼固定于創(chuàng)傷儀中，只隨創(chuàng)傷儀轉(zhuǎn)動(dòng)而不由高處跌落。
　　 2.大鼠心電圖（ECG）、平均動(dòng)脈壓（MABP）及在體心功能的檢測(cè)將大鼠麻醉、固定、順序連接心電圖電極針后，將連有壓力換能器的聚乙烯導(dǎo)管沿右側(cè)頸總動(dòng)脈插入左心室，采用BL-410生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)記錄大鼠ECG、MABP及大鼠左心室收縮壓（Left Ventricular Systolic Pressure

7、，LVSP）、左心室舒張壓（Left Ventricular Diastolic Pressure，LVDP）、左心室壓力上升和下降最大變化速率（±dP/dTmax）等心功能數(shù)據(jù)。
　　 3.大鼠離體心功能的檢測(cè)將大鼠擊昏、迅速開(kāi)胸取出心臟，于Krebs-Henseleit（K-H液：118mM NaCl, 4.75mM KCl, 1.19mM KH2PO4, 1.19mM MgSO4·7H2O, 2.54mM CaCl2·2H

8、2O, 25mM NaHCO3, 0.5mM EDTA, and 11mM glucose）液中修剪后將主動(dòng)脈懸掛于Langendorff 灌流裝置，以K-H液灌流。將起搏電極置于右心室，將一連有壓力換能器的乳膠水囊經(jīng)左心房插入左心室內(nèi)檢測(cè)大鼠離體心功能。采用BL-410生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)記錄大鼠LVSP、LVDP、±dP/dTmax等心功能數(shù)據(jù)。
　　 4.大鼠心肌缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/

9、R）模型的制備將大鼠麻醉固定后，做頸部正中切口，行氣管插管，四肢連接心電監(jiān)測(cè)電極。在心搏最明顯處開(kāi)胸、暴露心臟，打開(kāi)心包，將6-0帶針縫合線于左心耳根部下方2mm處穿過(guò)心肌表層，在肺動(dòng)脈圓錐旁出針，將雙線頭一同穿入一塑料管，心電圖穩(wěn)定后按壓塑料管阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支血流，心電圖Ⅱ?qū)?lián)顯示ST段弓背抬高，認(rèn)為缺血成功。以止血鉗固定塑料管，缺血30min后，放松止血鉗使冠脈血流恢復(fù)再通，實(shí)現(xiàn)心肌再灌注，再灌注3h。
　　 5.肌酸激

10、酶同工酶MB（Creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB）的檢測(cè)
　　 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)大鼠血清CK-MB的含量。依次加入待測(cè)血清樣品、一抗工作液、酶標(biāo)抗體工作液、底物工作液、終止液后，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光度值（OD值），以O(shè)D值的大小代表大鼠血清CK-MB的含量。
　　 6. 統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)

11、，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，使用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.機(jī)械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h內(nèi)ECG、MABP未出現(xiàn)明顯改變
　　 大鼠在Noble-Collip鼓中以40轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)5min后，創(chuàng)傷后24h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)ECG、MABP未出現(xiàn)明顯變化，且大鼠內(nèi)臟未出現(xiàn)明顯的出血，24h內(nèi)生存率為100％（見(jiàn)圖3、4、5）。
　　

12、 2.機(jī)械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h內(nèi)在體心功能未出現(xiàn)明顯改變
　　 分別以+dP/dTmax和-dP/dTmax來(lái)反映左室心肌收縮和舒張能力。創(chuàng)傷后24h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)±dP/dTmax分別與偽創(chuàng)傷組相比，均無(wú)明顯差異（P>0.05）（見(jiàn)圖6）。
　　 3.機(jī)械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h離體心功能降低
　　 與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷后0h、3h、6h和12h的±dP/dTmax均無(wú)明顯差異（P>0.05）；而創(chuàng)傷后24h的+dP/

13、dTmax和-dP/dTmax均顯著降低[+dP/dTmax：（3414±208）mmHg/sec，vs.（4251±168）mmHg/sec，P<0.01；-dP/dTmax：（-3301±458）mmHg/secvs.（-5221±488）mmHg/sec，P<0.01]（見(jiàn)圖7）。
　　 以上結(jié)果提示以40轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)5min所制備的創(chuàng)傷模型可能能夠模擬臨床創(chuàng)傷后入院觀察24h內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)造成冠脈夾層等直接的心臟損傷

14、，同時(shí)也未發(fā)現(xiàn)其它內(nèi)臟直接受損，卻在創(chuàng)傷后數(shù)天或數(shù)周出現(xiàn)了心臟受損的這類(lèi)臨床損傷情況。
　　 4.機(jī)械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后1周在體心功能未出現(xiàn)明顯改變
　　 為了觀察此模型在創(chuàng)傷后1周（臨床容易出現(xiàn)繼發(fā)性心臟受損的時(shí)間點(diǎn)）心功能的變化情況，我們將創(chuàng)傷大鼠喂養(yǎng)1周后觀察其±dP/dTmax，結(jié)果顯示，創(chuàng)傷后1周的+dP/dTmax為（5580±215）mmHg/sec，與偽創(chuàng)傷組+dP/dTmax（5810±460）mmHg/s

15、ec相比，無(wú)顯著性差別（P>0.05）（見(jiàn)圖8）；創(chuàng)傷后1周-dP/dTmax為（-4390±87）mmHg/sec，與偽創(chuàng)傷組-dP/dTmax（-4735±544）mmHg/sec相比，也無(wú)顯著性差別（P>0.05）（見(jiàn)圖8）。
　　 5. 機(jī)械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后1周對(duì)缺血/再灌注損傷的敏感性增加
　　 為了進(jìn)一步觀察創(chuàng)傷后心肌對(duì)缺血/再灌注損傷（一種常見(jiàn)的不良刺激）的敏感性，我們將喂養(yǎng)1周的創(chuàng)傷大鼠進(jìn)行缺血30min、

16、再灌注3h處理，并觀察在體心功能和血清CK-MB的變化。結(jié)果顯示，與偽創(chuàng)傷缺血/再灌注組相比，創(chuàng)傷缺血/再灌注組+dP/dTmax顯著降低[（2012±201）mmHg/secvs.（3663±190）mmHg/sec，P<0.01]（見(jiàn)圖9），-dP/dTmax也明顯降低[（-1616±230）mmHg/secvs.-dP/dTmax（-2602±246）mmHg/sec，P<0.01]（見(jiàn)圖9）；此外，與偽創(chuàng)傷缺血/再灌注組相比，創(chuàng)

17、傷缺血/再灌注組大鼠血清CK-MB水平顯著升高[（4984±719）ng/mlvs.（2978±506）ng/ml，P<0.01）]（見(jiàn)圖10）。
　　 小結(jié)一
　　 結(jié)合臨床出現(xiàn)的病例（即“一些機(jī)械創(chuàng)傷患者在入院觀察24h內(nèi)未發(fā)現(xiàn)直接的心臟損傷，卻在創(chuàng)傷后數(shù)天或數(shù)周出現(xiàn)了心肌梗死”），同時(shí)為了符合臨床只能對(duì)患者進(jìn)行無(wú)創(chuàng)檢查的實(shí)際情況，我們所制備的創(chuàng)傷模型應(yīng)該滿足：創(chuàng)傷后24h內(nèi)無(wú)創(chuàng)檢查（ECG、MABP檢測(cè)）正常，但卻

18、存在隱匿性的心臟損傷，而這極有可能誘發(fā)創(chuàng)傷后的繼發(fā)性心臟損傷。
　　 通過(guò)本部分實(shí)驗(yàn)，我們觀察到利用40轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)5min所制備的創(chuàng)傷模型，其創(chuàng)傷后24h內(nèi)ECG、MABP、在體心功能未出現(xiàn)明顯改變，而創(chuàng)傷后24h離體心功能降低，盡管隨后1周創(chuàng)傷大鼠在體心功能仍然正常，但對(duì)心臟疾病高危因素之一—缺血/再灌注損傷的敏感性卻顯著增加，這些結(jié)果高度提示此模型能夠模擬臨床創(chuàng)傷后入院觀察24h內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)造成冠脈夾層等直接的心臟損

19、傷，同時(shí)也未發(fā)現(xiàn)其它內(nèi)臟直接受損，卻在創(chuàng)傷后出現(xiàn)繼發(fā)性心臟受損的這類(lèi)臨床損傷情況。
　　 第二部分
　　 目的
　　 通過(guò)觀察創(chuàng)傷后24h內(nèi)心肌細(xì)胞死亡（壞死和/或凋亡）的發(fā)生特點(diǎn)，探討機(jī)械創(chuàng)傷致繼發(fā)性心臟損傷的可能原因。
　　 方法
　　 1.心肌肌鈣蛋白I（cTnI）的檢測(cè)采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)大鼠血清cTnI的含量。依次加入待測(cè)血清、一抗工作液、酶標(biāo)抗體工作液、底物工作液、終

20、止液后，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光度值（OD值），以O(shè)D值的大小代表大鼠血清cTnI的含量。
　　 2.DNA原位末端缺口標(biāo)記法（TUNEL法）檢測(cè)心肌組織的細(xì)胞凋亡
　　 將心肌組織石蠟切片后，依次脫蠟、封閉、滴加一抗、二抗、TUNEL反應(yīng)混合溶液及DAPI 染液后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，藍(lán)色代表所有細(xì)胞核，綠色代表凋亡細(xì)胞核。計(jì)算各視野范圍內(nèi)的全部細(xì)胞數(shù)和凋

21、亡細(xì)胞數(shù)，凋亡細(xì)胞數(shù)除以全部細(xì)胞數(shù)即為凋亡比例，用凋亡指數(shù)表示。
　　 3.心肌組織Caspase-3、12活性測(cè)定Caspase-3、12活性使用Caspase-3和Caspase-12熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。制備心肌組織樣品，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將酶標(biāo)板各樣品孔中依次加入樣品裂解液、反應(yīng)緩沖液及底物后，設(shè)定酶標(biāo)儀參數(shù)（激發(fā)波長(zhǎng)400nm，發(fā)射波長(zhǎng)505nm）后測(cè)定吸光度值（OD值），以每孔OD值除以其蛋白濃度后的

22、值代表大鼠心肌組織Caspase-3、12活性。
　　 4.心肌組織Caspase-8、9活性測(cè)定制備心肌組織樣品，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將酶標(biāo)板各樣品孔中依次加入反應(yīng)緩沖液、樣品裂解液、雙蒸水及底物工作液后，設(shè)定酶標(biāo)儀參數(shù)（激發(fā)波長(zhǎng)400nm，發(fā)射波長(zhǎng)505nm）后測(cè)定吸光度值（OD值），以每孔OD值除以其蛋白濃度后的值代表大鼠心肌組織Caspase-8、9活性。
　　 5. 心肌組織蛋白濃度的測(cè)定（BC

23、A法） 配制各濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，將酶標(biāo)板各孔中加入一定體積的工作液和標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，孵育半小時(shí)后在酶標(biāo)儀512nm下讀數(shù)，得到吸光度值（OD值）。
　　 6.大鼠在體心功能及大鼠血清肌酸激酶同工酶MB（Creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB）的檢測(cè)方法同第一部分。
　　 7. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單

24、因素方差分析，使用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.機(jī)械創(chuàng)傷未引起明顯的大鼠心肌細(xì)胞壞死
　　 （1） 機(jī)械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h內(nèi)血清CK-MB未出現(xiàn)明顯改變CK-MB是反映心肌細(xì)胞損傷壞死的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。將各個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的CK-MB含量分別與偽創(chuàng)傷組相比，均無(wú)明顯差異（P>0.05）（見(jiàn)圖11）。
　　 （2） 機(jī)械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h內(nèi)

25、血清cTnI未出現(xiàn)明顯改變
　　 nI是近年發(fā)展起來(lái)的一種高靈敏、高特異性的反映心肌細(xì)胞損傷壞死的血清標(biāo)記物。將各個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的cTnI含量分別與偽創(chuàng)傷組相比，均無(wú)明顯差異（P>0.05）（見(jiàn)圖12）。
　　 以上結(jié)果提示，創(chuàng)傷后24h顯著降低的離體心臟收縮、舒張功能可能并非由于心肌細(xì)胞壞死所致。
　　 2.機(jī)械創(chuàng)傷使大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加
　　 （1） 機(jī)械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h內(nèi)心肌細(xì)胞凋亡的時(shí)間變化規(guī)律

26、采用TUNEL和Caspase-3活性測(cè)定兩種方法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與偽創(chuàng)傷組（Sham，0.18％±0.05％）相比，創(chuàng)傷后6h凋亡指數(shù)顯著增加（6.71％±1.91％，P<0.01）；至創(chuàng)傷后12h達(dá)最高（14.42％±3.46％，P<0.01vs. Sham），創(chuàng)傷后24h仍維持在較高水平（8.12％±2.54％，P<0.01vs. Sham）（見(jiàn)圖13）；Caspase-3活性也是創(chuàng)傷后6h顯著增加（51±4），至

27、創(chuàng)傷后12h達(dá)最高（69±4），創(chuàng)傷后24h仍維持在較高水平（46±3），與偽創(chuàng)傷組（16.2±2.0）相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）（見(jiàn)圖14）。
　　 （2） 給予廣譜Caspase抑制劑Z-VAD-FMK對(duì)創(chuàng)傷后離體心功能的影響為了觀察心肌細(xì)胞凋亡在創(chuàng)傷所致的心功能障礙中的作用，創(chuàng)傷后隨即給予廣譜Caspase抑制劑Z-VAD-FMK，采用Langendorff離體灌流系統(tǒng)檢測(cè)大鼠離體心功能，分別以+dP/dTma

28、x和-dP/dTmax來(lái)反映左室心肌收縮和舒張能力。結(jié)果顯示，給予廣譜Caspase抑制劑Z-VAD-FMK后，創(chuàng)傷后24h的+dP/dTmax為（4111±189）mmHg/sec，與創(chuàng)傷組+dP/dTmax（3414±208）mmHg/sec相比顯著升高（P<0.01）；給予Z-VAD-FMK后，創(chuàng)傷后24h的-dP/dTmax為（-4997±351）mmHg/sec，與創(chuàng)傷組-dP/dTmax（-3301±458）mmHg/sec

29、相比也明顯升高（P<0.05）（見(jiàn)圖15）。
　　 以上結(jié)果表明給予廣譜Caspase抑制劑Z-VAD-FMK后，創(chuàng)傷后降低的離體心功能恢復(fù)了約80％，提示心肌細(xì)胞凋亡在機(jī)械創(chuàng)傷所致的繼發(fā)性心臟損傷中發(fā)揮著重要作用。
　　 （3） 機(jī)械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h內(nèi)心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生的可能途徑通過(guò)檢測(cè)Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12的活性來(lái)探討機(jī)械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h內(nèi)心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生的可能途徑。結(jié)果顯

30、示，與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷后3h Caspase-12活性顯著升高（66±8），6h達(dá)到最高（89±16），與偽創(chuàng)傷組（27±10）相比均具有顯著性差異（P<0.01），但創(chuàng)傷后12h又顯著下降（32±8），與偽創(chuàng)傷組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）（見(jiàn)圖18）；而Caspase-8活性在創(chuàng)傷后24h明顯升高（2312±648），與偽創(chuàng)傷組（1449±296）相比有顯著性差異（P<0.01）（見(jiàn)圖16）；Caspase-9活性也是在創(chuàng)傷后2

31、4h明顯升高（875±460），與偽創(chuàng)傷組（470±222）相比有顯著性差異（P<0.01）（見(jiàn)圖17）。
　　 以上結(jié)果提示創(chuàng)傷早期首先通過(guò)激活Caspase-12，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑而引起心肌細(xì)胞凋亡
　　 cT，隨后通過(guò)激活Caspase-8（外源性途徑）和Caspase-9（內(nèi)源性途徑）引起心肌細(xì)胞凋亡。
　　 小結(jié)二
　　 1.機(jī)械創(chuàng)傷后24h顯著降低的離體心臟收縮、舒張功能可能與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)；<

32、br>　　 2.機(jī)械創(chuàng)傷早期通過(guò)激活Caspase-12，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑而引起心肌細(xì)胞凋亡，隨后通過(guò)激活Caspase-8（外源性途徑）和Caspase-9（內(nèi)源性途徑）引起心肌細(xì)胞凋亡。
　　 第三部分
　　 目的
　　 1.觀察機(jī)械創(chuàng)傷時(shí)活性氧、一氧化氮（NO）的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)的發(fā)生特征；
　　 2.探討活性氧、NO因素和炎癥反應(yīng)在機(jī)械創(chuàng)傷致心肌細(xì)胞凋亡中的作用和機(jī)制。
　　 方法
　　

33、 1.大鼠心肌組織總NO（Nox）含量的測(cè)定（LDH法） 將心肌組織勻漿、離心、取上清，制備硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品后，在酶標(biāo)板各孔中依次加入雙蒸水、樣品、緩沖液及NADPH、硝酸還原酶混合物、輔因子溶液、LDH溶液，孵育后再加入Griess試劑R1和R2，在酶標(biāo)儀540nm或550nm下測(cè)定OD值，以O(shè)D值的大小代表大鼠心肌組織Nox的含量。
　　 2.大鼠心肌組織超氧陰離子（O2﹒-）的測(cè)定使用光澤精加強(qiáng)發(fā)光法檢測(cè)心肌組織中O2﹒-的

34、產(chǎn)生量。將心肌組織放入含有光澤精（0.25mM）的PBS液中，RLU（相對(duì)發(fā)光單位）用BD公司的Monolight 2010發(fā)光計(jì)來(lái)測(cè)定。O2﹒-用RLU/mg蛋白表示。
　　 3.大鼠心肌組織硝基酪氨酸（NT）含量的檢測(cè)采用ELISA方法檢測(cè)大鼠心肌組織NT含量。將心肌組織勻漿、離心后，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。用抗硝基酪氨酸單克隆抗體封板后，將標(biāo)準(zhǔn)品或心肌組織樣品上清、酶標(biāo)二抗依次加入酶標(biāo)板各孔，OPD 顯色，在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)49

35、0nm處測(cè)定吸光度值（OD值）。NT含量通過(guò)已知濃度硝化牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，表達(dá)為nmol/g蛋白。
　　 4.Western blot測(cè)定一氧化氮合酶（NOS：iNOS，eNOS）含量
　　 將心肌組織勻漿、離心后取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制8％凝膠，上樣（上樣量iNOS為30μg/孔，eNOS為60μg/孔）、電泳、轉(zhuǎn)膜（半干式）、封閉、經(jīng)過(guò)一抗、二抗反應(yīng)后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，利用Image-Pro Plu

36、s5.0軟件進(jìn)行條帶分析。用目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參β-actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。
　　 5. 胸主動(dòng)脈內(nèi)皮功能的測(cè)定將制備好的胸主動(dòng)脈環(huán)懸掛于連有張力換能器的器官浴管中，浴管中盛有K-H液（37°C，95％ O2+5％ CO2）。調(diào)節(jié)最適前負(fù)荷至1.0g，待血管環(huán)穩(wěn)定后，以去氧腎上腺素誘發(fā)血管收縮，分別觀察創(chuàng)傷大鼠胸主動(dòng)脈對(duì)內(nèi)皮依賴性舒血管物質(zhì)Ach和非內(nèi)皮依賴性舒血管物質(zhì)酸化NaNO

37、2的反應(yīng)性。以血管對(duì)Ach的反應(yīng)性下降而對(duì)酸化NaNO2的反應(yīng)性正常作為評(píng)判血管內(nèi)皮功能障礙的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 6. 心肌組織髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性檢測(cè)采用比色法測(cè)定MPO活性。按重量體積比為1：19加勻漿介質(zhì)制成5％的心肌組織勻漿，按照說(shuō)明書(shū)依次加入各試劑后，用酶標(biāo)儀于460nm處測(cè)定吸光度值（OD值），結(jié)果以每孔OD值除以其蛋白濃度后的值代表大鼠心肌組織MPO活性。
　　 7. 心肌組織MPO釋放和ICAM-1表達(dá)的

38、測(cè)定（免疫組化方法） 將心肌組織進(jìn)行石蠟切片、脫蠟、抗原修復(fù)、封閉、滴加一抗、二抗及鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，DAB顯色、復(fù)染、封固。用此法來(lái)檢測(cè)心肌組織MPO釋放量和ICAM-1的表達(dá)情況。
　　 8. 心肌組織蛋白濃度的測(cè)定，心肌組織Caspase-3活性測(cè)定及TUNEL等方法同第二部分。
　　 9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較

39、采用單因素方差分析，使用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 用GrahPad Prism4.0對(duì)離體動(dòng)脈血管環(huán)結(jié)果進(jìn)行Logistic曲線擬合。
　　 Western-blot結(jié)果采用Image-Pro Plus5.0軟件進(jìn)行圖像分析。
　　 結(jié)果
　　 1.氧自由基和氮自由基在機(jī)械創(chuàng)傷致心肌細(xì)胞凋亡中的可能作用
　　 （1）大鼠創(chuàng)傷后24h內(nèi)心肌組

40、織O2﹒-水平的變化偽創(chuàng)傷組大鼠心肌組織O2﹒-含量為（12.7±1.8）RLU/mg組織，機(jī)械創(chuàng)傷后6h 心肌
　　 組織O2﹒-含量顯著升高為（36.4±3.5）RLU/mg組織，二者相比具有顯著性差異（P<0.01）（見(jiàn)圖19）。創(chuàng)傷后12h心肌組織O2﹒-含量仍維持高水平，為（29.6±4.2）RLU/mg組織，與偽創(chuàng)傷組相比有顯著性差異（P<0.01）（見(jiàn)圖19）。
　　 （2）大鼠創(chuàng)傷后24h內(nèi)心肌組織Nox

41、含量的變化偽創(chuàng)傷組大鼠心肌組織Nox含量為（2.12±1.1）μmol/g蛋白，機(jī)械創(chuàng)傷后6h 心肌組織Nox含量顯著升高為（9.5±1.9）μmol/g蛋白，二者相比具有顯著性差異（P<0.01）（見(jiàn)圖20）。創(chuàng)傷后12h心肌組織Nox含量達(dá)最高，為（17.2±2.3）μmol/g蛋白，與偽創(chuàng)傷組相比有顯著性差異（P<0.01）（見(jiàn)圖20）。
　　 以上結(jié)果提示機(jī)械創(chuàng)傷可以引起活性氧和NO的產(chǎn)生顯著增加。
　　 （3）

42、 機(jī)械創(chuàng)傷大鼠心肌組織NT含量的改變及其可能的意義在很多病理情況下，大量生成的NO主要通過(guò)與O2·-結(jié)合生成ONOO-（其含量通常用NT水平反映）來(lái)發(fā)揮毒性作用，為了探討機(jī)械創(chuàng)傷時(shí)ONOO-是否也增加，我們檢測(cè)了創(chuàng)傷后NT的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠創(chuàng)傷后12h心肌組織NT含量為（12.2±1.1）nmol/g蛋白，與偽創(chuàng)傷組（0.78±0.26）nmol/g蛋白相比，具有顯著性差異（P<0.01）（見(jiàn)圖21）。
　　 為了探討升高的

43、ONOO-對(duì)心肌組織Nox、NT水平和Caspase-3活性的影響，我們?cè)趧?chuàng)傷后隨即給予了ONOO-清除劑FeTMPyP。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予FeTMPyP后，創(chuàng)傷后12h心肌組織Nox含量為（16.2±2.1）μmol/g蛋白，與創(chuàng)傷組（17.2±2.3）μmol/g蛋白相比無(wú)明顯差別（P>0.05）（見(jiàn)圖22）；給予FeTMPyP后，創(chuàng)傷后12h心肌組織NT水平明顯降低為（3.2±1.0）nmol/g蛋白，與創(chuàng)傷組（12.2±1.1）nm

44、ol/g蛋白相比有顯著性差異（P<0.01）（見(jiàn)圖23）；給予FeTMPyP后，創(chuàng)傷后12h心肌組織Caspase-3活性為（31.2±1.9），與創(chuàng)傷組（68.5±3.9）相比顯著降低（P<0.01）（見(jiàn)圖24）。此外，我們意外地發(fā)現(xiàn)給予FeTMPyP后，創(chuàng)傷后心肌組織NT含量?jī)H下降了約74％，而并未使NT含量完全恢復(fù)正常。
　　 上述結(jié)果表明機(jī)械創(chuàng)傷時(shí)ONOO-含量增加，給予ONOO-清除劑FeTMPyP可以部分降低機(jī)械創(chuàng)傷

45、所引起的心肌細(xì)胞凋亡，提示ONOO-是導(dǎo)致創(chuàng)傷后心肌細(xì)胞凋亡的可能原因；此外，由于給予FeTMPyP并未使NT含量完全恢復(fù)正常，提示NT升高的原因除了傳統(tǒng)認(rèn)為的由ONOO-升高所致外，可能還存在其它的機(jī)制。
　　 （4） 機(jī)械創(chuàng)傷大鼠心肌組織iNOS和eNOS的表達(dá)變化及其可能的意義為了探討機(jī)械創(chuàng)傷時(shí)升高Nox的酶的來(lái)源，我們檢測(cè)了心肌組織iNOS和eNOS的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠機(jī)械創(chuàng)傷后6h心肌組織iNOS表達(dá)顯著增加，創(chuàng)傷后

46、12h達(dá)最高，24h仍維持在較高水平，與偽創(chuàng)傷組相比，均具有顯著性差異（P<0.01）（見(jiàn)圖25）。而創(chuàng)傷后各時(shí)間點(diǎn)eNOS水平與偽創(chuàng)傷組相比，無(wú)顯著性差別（P>0.05）（見(jiàn)圖26）。
　　 為了闡明升高的iNOS對(duì)心肌組織Nox、NT水平和Caspase-3活性的影響，隨后給予了iNOS抑制劑1400W處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1400W處理可以阻止創(chuàng)傷大鼠心肌組織Nox、NT水平和Caspase-3活性的升高，即給予1400W后，創(chuàng)

47、傷后12h心肌組織Nox水平為（4.5±0.6）μmol/g蛋白；心肌組織NT水平為（6.3±1.5）nmol/g蛋白，Caspase-3活性為（41.7±2.6），分別與創(chuàng)傷組Nox、NT水平和Caspase-3活性相比，均顯著降低（P<0.01）（見(jiàn)圖27，28，29）。
　　 以上結(jié)果提示，機(jī)械創(chuàng)傷有可能通過(guò)增加iNOS表達(dá)，進(jìn)而引起Nox生成增加，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。
　　 2.炎癥反應(yīng)在機(jī)械創(chuàng)傷致心肌細(xì)胞凋亡

48、中的作用
　　 （1） 機(jī)械創(chuàng)傷時(shí)大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能的變化炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，最先出現(xiàn)的是內(nèi)皮功能障礙，因此首先觀察了創(chuàng)傷后內(nèi)皮功能的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予10－9-10－5 mol/L累積濃度的Ach后，創(chuàng)傷組血管最大舒張程度與偽創(chuàng)傷組相比有顯著性差異，血管最大舒張程度由85.89％±6.12％降低到61.55％±6.42％（P<0.01，見(jiàn)圖30A）；而給予10－9-10－6 mol/L累積濃度的酸化NaNO2后，兩組間的血

49、管舒張程度無(wú)明顯差別（P>0.01，見(jiàn)圖30B）。這一結(jié)果提示機(jī)械創(chuàng)傷可以導(dǎo)致大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性的舒張功能障礙。
　　 （2） 機(jī)械創(chuàng)傷大鼠心肌組織ICAM-1表達(dá)的變化ICAM-1是介導(dǎo)炎癥時(shí)中性粒細(xì)胞（PMN）黏附所必需的黏附分子。采用免疫組化方法檢測(cè)創(chuàng)傷后6h大鼠心肌組織ICAM-1的表達(dá)。結(jié)果顯示，與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷組心肌組織ICAM-1表達(dá)明顯增加（見(jiàn)圖31）。
　　 （3） 機(jī)械創(chuàng)傷大鼠心肌組織MPO的

50、活性和釋放PMN是炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，激活后可以釋放MPO，通常將MPO作為PMN聚集的標(biāo)志物。我們分別采用比色法和免疫組化方法檢測(cè)創(chuàng)傷后大鼠心肌組織MPO的活性和釋放。結(jié)果顯示，偽創(chuàng)傷組心肌組織MPO活性為（0.58±0.24）U/g蛋白，創(chuàng)傷后6h心肌組織MPO活性顯著升高為（2.91±0.36）U/g蛋白，二者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，見(jiàn)圖32A）。創(chuàng)傷后12h MPO活性達(dá)到最大（4.41±0.72）U/g蛋白，與偽

51、創(chuàng)傷組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，見(jiàn)圖32A）。同時(shí)，與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷組大鼠創(chuàng)傷后6h心肌組織MPO釋放量明顯增加（見(jiàn)圖32B）。
　　 以上結(jié)果提示機(jī)械創(chuàng)傷可以引起炎癥的基本病理改變，即血管內(nèi)皮受損，心肌組織細(xì)胞粘附分子ICAM-1表達(dá)增加，MPO釋放增多，活性增強(qiáng)。
　　 （4） 給予MPO抑制劑對(duì)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響
　　 為了進(jìn)一步探討炎癥反應(yīng)在機(jī)械創(chuàng)傷所致的心肌細(xì)胞凋亡中是否也發(fā)揮著一定的作

52、用，我們給予MPO抑制劑ABAH處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予MPO抑制劑ABAH后，心肌細(xì)胞凋亡程度顯著下降為（7.22％±1.24％），與創(chuàng)傷組（14.42％±0.46％）相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（見(jiàn)圖33）。
　　 以上結(jié)果提示，MPO抑制劑ABAH可以部分降低機(jī)械創(chuàng)傷所引起的心肌細(xì)胞凋亡。
　　 （5） MPO參與心肌組織NT水平的增高已有文獻(xiàn)報(bào)道，機(jī)體除了ONOO-外，還存在非ONOO-蛋白質(zhì)硝基化（選擇性硝化酪

53、氨酸殘基）途徑，其中最常見(jiàn)的是MPO導(dǎo)致的蛋白質(zhì)硝基化。為了觀察創(chuàng)傷后升高的NT是否與MPO有關(guān)，因此給予了MPO抑制劑ABAH處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予ABAH后，心肌組織NT水平顯著下降為（5.15±1.15）nmol/g蛋白，與創(chuàng)傷組（12.2±1.1）nmol/g蛋白相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（見(jiàn)圖34）。
　　 這一結(jié)果提示機(jī)械創(chuàng)傷時(shí)MPO可能通過(guò)增加NT水平，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。
　　 小結(jié)三