心肌細胞凋亡在機械創(chuàng)傷致繼發(fā)性心臟損傷中的作用及其可能機制.pdf

1、研究背景
　　 機械性外傷是一個主要的醫(yī)療和經(jīng)濟問題，是一種臨床常見的損傷。機械性外傷可以引起出血性休克、組織損傷和循環(huán)因子的釋放，并且在傷者初步穩(wěn)定后仍可能繼續(xù)威脅生命。雖然臨床和實驗研究已經(jīng)證實，損傷后器官功能衰竭是損傷晚期死亡的最主要原因，但繼發(fā)性組織損傷的機理在很大程度上尚不明了。因此，鑒定外傷后器官損傷，探討相應器官功能失調機理以尋求相應的治療方案，從而減少一切與外傷相關的繼發(fā)性器官損傷是非常關鍵的。
　　 隨

2、著院前急救體系的建立和完善，原發(fā)性機械損傷已得到有效控制，但繼發(fā)性損傷，因其容易漏診，而成為威脅創(chuàng)傷患者的潛在殺手。臨床研究表明，一些機械創(chuàng)傷患者在入院觀察24h內未發(fā)現(xiàn)直接的心臟損傷，卻在創(chuàng)傷后數(shù)天或數(shù)周出現(xiàn)了心肌梗死。但是，機械性創(chuàng)傷導致的這種繼發(fā)性心臟損傷的具體機制尚不清楚。到目前為止，缺乏理想的動物模型，是制約其深入研究的主要瓶頸之一。
　　 我們在前期研究中，選用Noble-Collip鼓制備了一種能夠模擬臨床繼發(fā)心臟

3、損傷的機械創(chuàng)傷模型，發(fā)現(xiàn)以40轉/min的轉速轉動5min時，創(chuàng)傷大鼠在24h內心電圖、平均動脈壓及在體心功能均未發(fā)生明顯改變，但是創(chuàng)傷24h時離體心臟收縮、舒張功能均顯著降低。提示這種創(chuàng)傷模型可能引起繼發(fā)性心肌損傷，只是在機體神經(jīng)-體液因素的調節(jié)下，仍然能夠維持正常功能。但是，這種心肌損傷的病理生理學意義仍然需要進一步的探究。第一，這種模型是能夠直接引起創(chuàng)傷后的繼發(fā)性心臟損傷，還是能夠導致心臟組織對不良刺激的敏感性增高并不清楚。其次，

4、導致這種心肌損傷的機制是什么也不清楚。
　　 研究表明，機械創(chuàng)傷時大量產(chǎn)生的自由基（包括活性氧，一氧化氮）和炎性因子，是導致細胞死亡的主要原因。而后者的主要形式有壞死和凋亡兩種，一定數(shù)量的心肌細胞丟失將導致心臟功能障礙。探討外傷后心肌細胞丟失的機制將有利于尋找阻止外傷后心肌損傷的最佳治療方案，并引申到外傷后其他器官損傷的防治。本研究將采用離體、在體實驗模型和藥理學抑制劑等方法，探尋外傷后心肌細胞丟失的可能機制，從而為尋找防止創(chuàng)傷

5、后多器官功能衰竭的最佳治療提供實驗依據(jù)。
　　 第一部分
　　 目的
　　 觀察Noble-Collip鼓制備的機械創(chuàng)傷模型是否會導致繼發(fā)性心肌損傷，從而為揭示繼發(fā)性心臟損傷的可能機制提供研究條件，并奠定研究基礎。
　　 方法
　　 1.機械創(chuàng)傷模型的制備按照我們前期的研究選取體重約180g-220g的健康雄性SD大鼠，將其麻醉后放入直徑約30.5cm的Noble-Collip鼓中，以40轉/mi

6、n的轉速轉動5min，大鼠每轉動一圈跌落一次，偽創(chuàng)傷組大鼠用膠帶黏貼固定于創(chuàng)傷儀中，只隨創(chuàng)傷儀轉動而不由高處跌落。
　　 2.大鼠心電圖（ECG）、平均動脈壓（MABP）及在體心功能的檢測將大鼠麻醉、固定、順序連接心電圖電極針后，將連有壓力換能器的聚乙烯導管沿右側頸總動脈插入左心室，采用BL-410生物信號記錄分析系統(tǒng)記錄大鼠ECG、MABP及大鼠左心室收縮壓（Left Ventricular Systolic Pressure

7、，LVSP）、左心室舒張壓（Left Ventricular Diastolic Pressure，LVDP）、左心室壓力上升和下降最大變化速率（±dP/dTmax）等心功能數(shù)據(jù)。
　　 3.大鼠離體心功能的檢測將大鼠擊昏、迅速開胸取出心臟，于Krebs-Henseleit（K-H液：118mM NaCl, 4.75mM KCl, 1.19mM KH2PO4, 1.19mM MgSO4·7H2O, 2.54mM CaCl2·2H

8、2O, 25mM NaHCO3, 0.5mM EDTA, and 11mM glucose）液中修剪后將主動脈懸掛于Langendorff 灌流裝置，以K-H液灌流。將起搏電極置于右心室，將一連有壓力換能器的乳膠水囊經(jīng)左心房插入左心室內檢測大鼠離體心功能。采用BL-410生物信號記錄分析系統(tǒng)記錄大鼠LVSP、LVDP、±dP/dTmax等心功能數(shù)據(jù)。
　　 4.大鼠心肌缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/

9、R）模型的制備將大鼠麻醉固定后，做頸部正中切口，行氣管插管，四肢連接心電監(jiān)測電極。在心搏最明顯處開胸、暴露心臟，打開心包，將6-0帶針縫合線于左心耳根部下方2mm處穿過心肌表層，在肺動脈圓錐旁出針，將雙線頭一同穿入一塑料管，心電圖穩(wěn)定后按壓塑料管阻斷左冠狀動脈前降支血流，心電圖Ⅱ導聯(lián)顯示ST段弓背抬高，認為缺血成功。以止血鉗固定塑料管，缺血30min后，放松止血鉗使冠脈血流恢復再通，實現(xiàn)心肌再灌注，再灌注3h。
　　 5.肌酸激

10、酶同工酶MB（Creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB）的檢測
　　 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測大鼠血清CK-MB的含量。依次加入待測血清樣品、一抗工作液、酶標抗體工作液、底物工作液、終止液后，用酶標儀在450nm處測吸光度值（OD值），以OD值的大小代表大鼠血清CK-MB的含量。
　　 6. 統(tǒng)計處理實驗結果以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗

11、，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，使用SPSS15.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。P<0.05認為具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 1.機械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h內ECG、MABP未出現(xiàn)明顯改變
　　 大鼠在Noble-Collip鼓中以40轉/min的轉速轉動5min后，創(chuàng)傷后24h內各時間點ECG、MABP未出現(xiàn)明顯變化，且大鼠內臟未出現(xiàn)明顯的出血，24h內生存率為100％（見圖3、4、5）。
　　

12、 2.機械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h內在體心功能未出現(xiàn)明顯改變
　　 分別以+dP/dTmax和-dP/dTmax來反映左室心肌收縮和舒張能力。創(chuàng)傷后24h內各時間點±dP/dTmax分別與偽創(chuàng)傷組相比，均無明顯差異（P>0.05）（見圖6）。
　　 3.機械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h離體心功能降低
　　 與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷后0h、3h、6h和12h的±dP/dTmax均無明顯差異（P>0.05）；而創(chuàng)傷后24h的+dP/

13、dTmax和-dP/dTmax均顯著降低[+dP/dTmax：（3414±208）mmHg/sec，vs.（4251±168）mmHg/sec，P<0.01；-dP/dTmax：（-3301±458）mmHg/secvs.（-5221±488）mmHg/sec，P<0.01]（見圖7）。
　　 以上結果提示以40轉/min的轉速轉動5min所制備的創(chuàng)傷模型可能能夠模擬臨床創(chuàng)傷后入院觀察24h內，未發(fā)現(xiàn)造成冠脈夾層等直接的心臟損傷

14、，同時也未發(fā)現(xiàn)其它內臟直接受損，卻在創(chuàng)傷后數(shù)天或數(shù)周出現(xiàn)了心臟受損的這類臨床損傷情況。
　　 4.機械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后1周在體心功能未出現(xiàn)明顯改變
　　 為了觀察此模型在創(chuàng)傷后1周（臨床容易出現(xiàn)繼發(fā)性心臟受損的時間點）心功能的變化情況，我們將創(chuàng)傷大鼠喂養(yǎng)1周后觀察其±dP/dTmax，結果顯示，創(chuàng)傷后1周的+dP/dTmax為（5580±215）mmHg/sec，與偽創(chuàng)傷組+dP/dTmax（5810±460）mmHg/s

15、ec相比，無顯著性差別（P>0.05）（見圖8）；創(chuàng)傷后1周-dP/dTmax為（-4390±87）mmHg/sec，與偽創(chuàng)傷組-dP/dTmax（-4735±544）mmHg/sec相比，也無顯著性差別（P>0.05）（見圖8）。
　　 5. 機械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后1周對缺血/再灌注損傷的敏感性增加
　　 為了進一步觀察創(chuàng)傷后心肌對缺血/再灌注損傷（一種常見的不良刺激）的敏感性，我們將喂養(yǎng)1周的創(chuàng)傷大鼠進行缺血30min、

16、再灌注3h處理，并觀察在體心功能和血清CK-MB的變化。結果顯示，與偽創(chuàng)傷缺血/再灌注組相比，創(chuàng)傷缺血/再灌注組+dP/dTmax顯著降低[（2012±201）mmHg/secvs.（3663±190）mmHg/sec，P<0.01]（見圖9），-dP/dTmax也明顯降低[（-1616±230）mmHg/secvs.-dP/dTmax（-2602±246）mmHg/sec，P<0.01]（見圖9）；此外，與偽創(chuàng)傷缺血/再灌注組相比，創(chuàng)

17、傷缺血/再灌注組大鼠血清CK-MB水平顯著升高[（4984±719）ng/mlvs.（2978±506）ng/ml，P<0.01）]（見圖10）。
　　 小結一
　　 結合臨床出現(xiàn)的病例（即“一些機械創(chuàng)傷患者在入院觀察24h內未發(fā)現(xiàn)直接的心臟損傷，卻在創(chuàng)傷后數(shù)天或數(shù)周出現(xiàn)了心肌梗死”），同時為了符合臨床只能對患者進行無創(chuàng)檢查的實際情況，我們所制備的創(chuàng)傷模型應該滿足：創(chuàng)傷后24h內無創(chuàng)檢查（ECG、MABP檢測）正常，但卻

18、存在隱匿性的心臟損傷，而這極有可能誘發(fā)創(chuàng)傷后的繼發(fā)性心臟損傷。
　　 通過本部分實驗，我們觀察到利用40轉/min的轉速轉動5min所制備的創(chuàng)傷模型，其創(chuàng)傷后24h內ECG、MABP、在體心功能未出現(xiàn)明顯改變，而創(chuàng)傷后24h離體心功能降低，盡管隨后1周創(chuàng)傷大鼠在體心功能仍然正常，但對心臟疾病高危因素之一—缺血/再灌注損傷的敏感性卻顯著增加，這些結果高度提示此模型能夠模擬臨床創(chuàng)傷后入院觀察24h內，未發(fā)現(xiàn)造成冠脈夾層等直接的心臟損

19、傷，同時也未發(fā)現(xiàn)其它內臟直接受損，卻在創(chuàng)傷后出現(xiàn)繼發(fā)性心臟受損的這類臨床損傷情況。
　　 第二部分
　　 目的
　　 通過觀察創(chuàng)傷后24h內心肌細胞死亡（壞死和/或凋亡）的發(fā)生特點，探討機械創(chuàng)傷致繼發(fā)性心臟損傷的可能原因。
　　 方法
　　 1.心肌肌鈣蛋白I（cTnI）的檢測采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測大鼠血清cTnI的含量。依次加入待測血清、一抗工作液、酶標抗體工作液、底物工作液、終

20、止液后，用酶標儀在450nm處測吸光度值（OD值），以OD值的大小代表大鼠血清cTnI的含量。
　　 2.DNA原位末端缺口標記法（TUNEL法）檢測心肌組織的細胞凋亡
　　 將心肌組織石蠟切片后，依次脫蠟、封閉、滴加一抗、二抗、TUNEL反應混合溶液及DAPI 染液后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取10個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，藍色代表所有細胞核，綠色代表凋亡細胞核。計算各視野范圍內的全部細胞數(shù)和凋

21、亡細胞數(shù)，凋亡細胞數(shù)除以全部細胞數(shù)即為凋亡比例，用凋亡指數(shù)表示。
　　 3.心肌組織Caspase-3、12活性測定Caspase-3、12活性使用Caspase-3和Caspase-12熒光檢測試劑盒檢測。制備心肌組織樣品，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將酶標板各樣品孔中依次加入樣品裂解液、反應緩沖液及底物后，設定酶標儀參數(shù)（激發(fā)波長400nm，發(fā)射波長505nm）后測定吸光度值（OD值），以每孔OD值除以其蛋白濃度后的

22、值代表大鼠心肌組織Caspase-3、12活性。
　　 4.心肌組織Caspase-8、9活性測定制備心肌組織樣品，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將酶標板各樣品孔中依次加入反應緩沖液、樣品裂解液、雙蒸水及底物工作液后，設定酶標儀參數(shù)（激發(fā)波長400nm，發(fā)射波長505nm）后測定吸光度值（OD值），以每孔OD值除以其蛋白濃度后的值代表大鼠心肌組織Caspase-8、9活性。
　　 5. 心肌組織蛋白濃度的測定（BC

23、A法） 配制各濃度蛋白標準品及工作液，將酶標板各孔中加入一定體積的工作液和標準品或樣品，孵育半小時后在酶標儀512nm下讀數(shù)，得到吸光度值（OD值）。
　　 6.大鼠在體心功能及大鼠血清肌酸激酶同工酶MB（Creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB）的檢測方法同第一部分。
　　 7. 統(tǒng)計學分析實驗結果以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單

24、因素方差分析，使用SPSS15.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。P<0.05認為具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 1.機械創(chuàng)傷未引起明顯的大鼠心肌細胞壞死
　　 （1） 機械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h內血清CK-MB未出現(xiàn)明顯改變CK-MB是反映心肌細胞損傷壞死的一個檢測指標。將各個不同時間點的CK-MB含量分別與偽創(chuàng)傷組相比，均無明顯差異（P>0.05）（見圖11）。
　　 （2） 機械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h內

25、血清cTnI未出現(xiàn)明顯改變
　　 nI是近年發(fā)展起來的一種高靈敏、高特異性的反映心肌細胞損傷壞死的血清標記物。將各個不同時間點的cTnI含量分別與偽創(chuàng)傷組相比，均無明顯差異（P>0.05）（見圖12）。
　　 以上結果提示，創(chuàng)傷后24h顯著降低的離體心臟收縮、舒張功能可能并非由于心肌細胞壞死所致。
　　 2.機械創(chuàng)傷使大鼠心肌細胞凋亡增加
　　 （1） 機械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h內心肌細胞凋亡的時間變化規(guī)律

26、采用TUNEL和Caspase-3活性測定兩種方法檢測心肌細胞凋亡情況。結果顯示，與偽創(chuàng)傷組（Sham，0.18％±0.05％）相比，創(chuàng)傷后6h凋亡指數(shù)顯著增加（6.71％±1.91％，P<0.01）；至創(chuàng)傷后12h達最高（14.42％±3.46％，P<0.01vs. Sham），創(chuàng)傷后24h仍維持在較高水平（8.12％±2.54％，P<0.01vs. Sham）（見圖13）；Caspase-3活性也是創(chuàng)傷后6h顯著增加（51±4），至

27、創(chuàng)傷后12h達最高（69±4），創(chuàng)傷后24h仍維持在較高水平（46±3），與偽創(chuàng)傷組（16.2±2.0）相比，均具有統(tǒng)計學差異（P<0.01）（見圖14）。
　　 （2） 給予廣譜Caspase抑制劑Z-VAD-FMK對創(chuàng)傷后離體心功能的影響為了觀察心肌細胞凋亡在創(chuàng)傷所致的心功能障礙中的作用，創(chuàng)傷后隨即給予廣譜Caspase抑制劑Z-VAD-FMK，采用Langendorff離體灌流系統(tǒng)檢測大鼠離體心功能，分別以+dP/dTma

28、x和-dP/dTmax來反映左室心肌收縮和舒張能力。結果顯示，給予廣譜Caspase抑制劑Z-VAD-FMK后，創(chuàng)傷后24h的+dP/dTmax為（4111±189）mmHg/sec，與創(chuàng)傷組+dP/dTmax（3414±208）mmHg/sec相比顯著升高（P<0.01）；給予Z-VAD-FMK后，創(chuàng)傷后24h的-dP/dTmax為（-4997±351）mmHg/sec，與創(chuàng)傷組-dP/dTmax（-3301±458）mmHg/sec

29、相比也明顯升高（P<0.05）（見圖15）。
　　 以上結果表明給予廣譜Caspase抑制劑Z-VAD-FMK后，創(chuàng)傷后降低的離體心功能恢復了約80％，提示心肌細胞凋亡在機械創(chuàng)傷所致的繼發(fā)性心臟損傷中發(fā)揮著重要作用。
　　 （3） 機械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h內心肌細胞凋亡發(fā)生的可能途徑通過檢測Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12的活性來探討機械創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)傷后24h內心肌細胞凋亡發(fā)生的可能途徑。結果顯

30、示，與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷后3h Caspase-12活性顯著升高（66±8），6h達到最高（89±16），與偽創(chuàng)傷組（27±10）相比均具有顯著性差異（P<0.01），但創(chuàng)傷后12h又顯著下降（32±8），與偽創(chuàng)傷組相比無顯著差異（P>0.05）（見圖18）；而Caspase-8活性在創(chuàng)傷后24h明顯升高（2312±648），與偽創(chuàng)傷組（1449±296）相比有顯著性差異（P<0.01）（見圖16）；Caspase-9活性也是在創(chuàng)傷后2

31、4h明顯升高（875±460），與偽創(chuàng)傷組（470±222）相比有顯著性差異（P<0.01）（見圖17）。
　　 以上結果提示創(chuàng)傷早期首先通過激活Caspase-12，即內質網(wǎng)途徑而引起心肌細胞凋亡
　　 cT，隨后通過激活Caspase-8（外源性途徑）和Caspase-9（內源性途徑）引起心肌細胞凋亡。
　　 小結二
　　 1.機械創(chuàng)傷后24h顯著降低的離體心臟收縮、舒張功能可能與心肌細胞凋亡有關；<

32、br>　　 2.機械創(chuàng)傷早期通過激活Caspase-12，即內質網(wǎng)途徑而引起心肌細胞凋亡，隨后通過激活Caspase-8（外源性途徑）和Caspase-9（內源性途徑）引起心肌細胞凋亡。
　　 第三部分
　　 目的
　　 1.觀察機械創(chuàng)傷時活性氧、一氧化氮（NO）的產(chǎn)生和炎癥反應的發(fā)生特征；
　　 2.探討活性氧、NO因素和炎癥反應在機械創(chuàng)傷致心肌細胞凋亡中的作用和機制。
　　 方法
　　

33、 1.大鼠心肌組織總NO（Nox）含量的測定（LDH法） 將心肌組織勻漿、離心、取上清，制備硝酸鹽標準品后，在酶標板各孔中依次加入雙蒸水、樣品、緩沖液及NADPH、硝酸還原酶混合物、輔因子溶液、LDH溶液，孵育后再加入Griess試劑R1和R2，在酶標儀540nm或550nm下測定OD值，以OD值的大小代表大鼠心肌組織Nox的含量。
　　 2.大鼠心肌組織超氧陰離子（O2﹒-）的測定使用光澤精加強發(fā)光法檢測心肌組織中O2﹒-的

34、產(chǎn)生量。將心肌組織放入含有光澤精（0.25mM）的PBS液中，RLU（相對發(fā)光單位）用BD公司的Monolight 2010發(fā)光計來測定。O2﹒-用RLU/mg蛋白表示。
　　 3.大鼠心肌組織硝基酪氨酸（NT）含量的檢測采用ELISA方法檢測大鼠心肌組織NT含量。將心肌組織勻漿、離心后，用BCA法檢測蛋白濃度。用抗硝基酪氨酸單克隆抗體封板后，將標準品或心肌組織樣品上清、酶標二抗依次加入酶標板各孔，OPD 顯色，在酶標儀波長49

35、0nm處測定吸光度值（OD值）。NT含量通過已知濃度硝化牛血清白蛋白標準曲線計算，表達為nmol/g蛋白。
　　 4.Western blot測定一氧化氮合酶（NOS：iNOS，eNOS）含量
　　 將心肌組織勻漿、離心后取上清，用BCA法測定蛋白濃度。配制8％凝膠，上樣（上樣量iNOS為30μg/孔，eNOS為60μg/孔）、電泳、轉膜（半干式）、封閉、經(jīng)過一抗、二抗反應后，進行化學發(fā)光，利用Image-Pro Plu

36、s5.0軟件進行條帶分析。用目的蛋白的灰度值除以內參β-actin的灰度值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。
　　 5. 胸主動脈內皮功能的測定將制備好的胸主動脈環(huán)懸掛于連有張力換能器的器官浴管中，浴管中盛有K-H液（37°C，95％ O2+5％ CO2）。調節(jié)最適前負荷至1.0g，待血管環(huán)穩(wěn)定后，以去氧腎上腺素誘發(fā)血管收縮，分別觀察創(chuàng)傷大鼠胸主動脈對內皮依賴性舒血管物質Ach和非內皮依賴性舒血管物質酸化NaNO

37、2的反應性。以血管對Ach的反應性下降而對酸化NaNO2的反應性正常作為評判血管內皮功能障礙的標準。
　　 6. 心肌組織髓過氧化物酶（MPO）活性檢測采用比色法測定MPO活性。按重量體積比為1：19加勻漿介質制成5％的心肌組織勻漿，按照說明書依次加入各試劑后，用酶標儀于460nm處測定吸光度值（OD值），結果以每孔OD值除以其蛋白濃度后的值代表大鼠心肌組織MPO活性。
　　 7. 心肌組織MPO釋放和ICAM-1表達的

38、測定（免疫組化方法） 將心肌組織進行石蠟切片、脫蠟、抗原修復、封閉、滴加一抗、二抗及鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物，DAB顯色、復染、封固。用此法來檢測心肌組織MPO釋放量和ICAM-1的表達情況。
　　 8. 心肌組織蛋白濃度的測定，心肌組織Caspase-3活性測定及TUNEL等方法同第二部分。
　　 9.統(tǒng)計學分析實驗結果以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較

39、采用單因素方差分析，使用SPSS15.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。P<0.05認為具有統(tǒng)計學意義。
　　 用GrahPad Prism4.0對離體動脈血管環(huán)結果進行Logistic曲線擬合。
　　 Western-blot結果采用Image-Pro Plus5.0軟件進行圖像分析。
　　 結果
　　 1.氧自由基和氮自由基在機械創(chuàng)傷致心肌細胞凋亡中的可能作用
　　 （1）大鼠創(chuàng)傷后24h內心肌組

40、織O2﹒-水平的變化偽創(chuàng)傷組大鼠心肌組織O2﹒-含量為（12.7±1.8）RLU/mg組織，機械創(chuàng)傷后6h 心肌
　　 組織O2﹒-含量顯著升高為（36.4±3.5）RLU/mg組織，二者相比具有顯著性差異（P<0.01）（見圖19）。創(chuàng)傷后12h心肌組織O2﹒-含量仍維持高水平，為（29.6±4.2）RLU/mg組織，與偽創(chuàng)傷組相比有顯著性差異（P<0.01）（見圖19）。
　　 （2）大鼠創(chuàng)傷后24h內心肌組織Nox

41、含量的變化偽創(chuàng)傷組大鼠心肌組織Nox含量為（2.12±1.1）μmol/g蛋白，機械創(chuàng)傷后6h 心肌組織Nox含量顯著升高為（9.5±1.9）μmol/g蛋白，二者相比具有顯著性差異（P<0.01）（見圖20）。創(chuàng)傷后12h心肌組織Nox含量達最高，為（17.2±2.3）μmol/g蛋白，與偽創(chuàng)傷組相比有顯著性差異（P<0.01）（見圖20）。
　　 以上結果提示機械創(chuàng)傷可以引起活性氧和NO的產(chǎn)生顯著增加。
　　 （3）

42、 機械創(chuàng)傷大鼠心肌組織NT含量的改變及其可能的意義在很多病理情況下，大量生成的NO主要通過與O2·-結合生成ONOO-（其含量通常用NT水平反映）來發(fā)揮毒性作用，為了探討機械創(chuàng)傷時ONOO-是否也增加，我們檢測了創(chuàng)傷后NT的水平。結果發(fā)現(xiàn)，大鼠創(chuàng)傷后12h心肌組織NT含量為（12.2±1.1）nmol/g蛋白，與偽創(chuàng)傷組（0.78±0.26）nmol/g蛋白相比，具有顯著性差異（P<0.01）（見圖21）。
　　 為了探討升高的

43、ONOO-對心肌組織Nox、NT水平和Caspase-3活性的影響，我們在創(chuàng)傷后隨即給予了ONOO-清除劑FeTMPyP。結果發(fā)現(xiàn)，給予FeTMPyP后，創(chuàng)傷后12h心肌組織Nox含量為（16.2±2.1）μmol/g蛋白，與創(chuàng)傷組（17.2±2.3）μmol/g蛋白相比無明顯差別（P>0.05）（見圖22）；給予FeTMPyP后，創(chuàng)傷后12h心肌組織NT水平明顯降低為（3.2±1.0）nmol/g蛋白，與創(chuàng)傷組（12.2±1.1）nm

44、ol/g蛋白相比有顯著性差異（P<0.01）（見圖23）；給予FeTMPyP后，創(chuàng)傷后12h心肌組織Caspase-3活性為（31.2±1.9），與創(chuàng)傷組（68.5±3.9）相比顯著降低（P<0.01）（見圖24）。此外，我們意外地發(fā)現(xiàn)給予FeTMPyP后，創(chuàng)傷后心肌組織NT含量僅下降了約74％，而并未使NT含量完全恢復正常。
　　 上述結果表明機械創(chuàng)傷時ONOO-含量增加，給予ONOO-清除劑FeTMPyP可以部分降低機械創(chuàng)傷

45、所引起的心肌細胞凋亡，提示ONOO-是導致創(chuàng)傷后心肌細胞凋亡的可能原因；此外，由于給予FeTMPyP并未使NT含量完全恢復正常，提示NT升高的原因除了傳統(tǒng)認為的由ONOO-升高所致外，可能還存在其它的機制。
　　 （4） 機械創(chuàng)傷大鼠心肌組織iNOS和eNOS的表達變化及其可能的意義為了探討機械創(chuàng)傷時升高Nox的酶的來源，我們檢測了心肌組織iNOS和eNOS的表達。結果發(fā)現(xiàn)，大鼠機械創(chuàng)傷后6h心肌組織iNOS表達顯著增加，創(chuàng)傷后

46、12h達最高，24h仍維持在較高水平，與偽創(chuàng)傷組相比，均具有顯著性差異（P<0.01）（見圖25）。而創(chuàng)傷后各時間點eNOS水平與偽創(chuàng)傷組相比，無顯著性差別（P>0.05）（見圖26）。
　　 為了闡明升高的iNOS對心肌組織Nox、NT水平和Caspase-3活性的影響，隨后給予了iNOS抑制劑1400W處理。結果發(fā)現(xiàn)，1400W處理可以阻止創(chuàng)傷大鼠心肌組織Nox、NT水平和Caspase-3活性的升高，即給予1400W后，創(chuàng)

47、傷后12h心肌組織Nox水平為（4.5±0.6）μmol/g蛋白；心肌組織NT水平為（6.3±1.5）nmol/g蛋白，Caspase-3活性為（41.7±2.6），分別與創(chuàng)傷組Nox、NT水平和Caspase-3活性相比，均顯著降低（P<0.01）（見圖27，28，29）。
　　 以上結果提示，機械創(chuàng)傷有可能通過增加iNOS表達，進而引起Nox生成增加，從而導致心肌細胞凋亡。
　　 2.炎癥反應在機械創(chuàng)傷致心肌細胞凋亡

48、中的作用
　　 （1） 機械創(chuàng)傷時大鼠胸主動脈內皮舒張功能的變化炎癥反應發(fā)生時，最先出現(xiàn)的是內皮功能障礙，因此首先觀察了創(chuàng)傷后內皮功能的變化。結果發(fā)現(xiàn)，給予10－9-10－5 mol/L累積濃度的Ach后，創(chuàng)傷組血管最大舒張程度與偽創(chuàng)傷組相比有顯著性差異，血管最大舒張程度由85.89％±6.12％降低到61.55％±6.42％（P<0.01，見圖30A）；而給予10－9-10－6 mol/L累積濃度的酸化NaNO2后，兩組間的血

49、管舒張程度無明顯差別（P>0.01，見圖30B）。這一結果提示機械創(chuàng)傷可以導致大鼠胸主動脈內皮依賴性的舒張功能障礙。
　　 （2） 機械創(chuàng)傷大鼠心肌組織ICAM-1表達的變化ICAM-1是介導炎癥時中性粒細胞（PMN）黏附所必需的黏附分子。采用免疫組化方法檢測創(chuàng)傷后6h大鼠心肌組織ICAM-1的表達。結果顯示，與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷組心肌組織ICAM-1表達明顯增加（見圖31）。
　　 （3） 機械創(chuàng)傷大鼠心肌組織MPO的

50、活性和釋放PMN是炎癥反應的重要效應細胞，激活后可以釋放MPO，通常將MPO作為PMN聚集的標志物。我們分別采用比色法和免疫組化方法檢測創(chuàng)傷后大鼠心肌組織MPO的活性和釋放。結果顯示，偽創(chuàng)傷組心肌組織MPO活性為（0.58±0.24）U/g蛋白，創(chuàng)傷后6h心肌組織MPO活性顯著升高為（2.91±0.36）U/g蛋白，二者相比具有統(tǒng)計學意義（P<0.01，見圖32A）。創(chuàng)傷后12h MPO活性達到最大（4.41±0.72）U/g蛋白，與偽

51、創(chuàng)傷組相比，有統(tǒng)計學意義（P<0.01，見圖32A）。同時，與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷組大鼠創(chuàng)傷后6h心肌組織MPO釋放量明顯增加（見圖32B）。
　　 以上結果提示機械創(chuàng)傷可以引起炎癥的基本病理改變，即血管內皮受損，心肌組織細胞粘附分子ICAM-1表達增加，MPO釋放增多，活性增強。
　　 （4） 給予MPO抑制劑對心肌細胞凋亡指數(shù)的影響
　　 為了進一步探討炎癥反應在機械創(chuàng)傷所致的心肌細胞凋亡中是否也發(fā)揮著一定的作

52、用，我們給予MPO抑制劑ABAH處理。結果發(fā)現(xiàn)，給予MPO抑制劑ABAH后，心肌細胞凋亡程度顯著下降為（7.22％±1.24％），與創(chuàng)傷組（14.42％±0.46％）相比有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（見圖33）。
　　 以上結果提示，MPO抑制劑ABAH可以部分降低機械創(chuàng)傷所引起的心肌細胞凋亡。
　　 （5） MPO參與心肌組織NT水平的增高已有文獻報道，機體除了ONOO-外，還存在非ONOO-蛋白質硝基化（選擇性硝化酪

53、氨酸殘基）途徑，其中最常見的是MPO導致的蛋白質硝基化。為了觀察創(chuàng)傷后升高的NT是否與MPO有關，因此給予了MPO抑制劑ABAH處理。結果發(fā)現(xiàn)，給予ABAH后，心肌組織NT水平顯著下降為（5.15±1.15）nmol/g蛋白，與創(chuàng)傷組（12.2±1.1）nmol/g蛋白相比有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（見圖34）。
　　 這一結果提示機械創(chuàng)傷時MPO可能通過增加NT水平，進而導致心肌細胞凋亡。
　　 小結三