X盒結(jié)合蛋白1在糖尿病心肌病心肌細胞凋亡中的作用機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病心肌病（diabeticcardiomyopathy，DCM）被認為是一種與糖尿病(diabetesmellitus，DM)相關(guān)的心肌結(jié)構(gòu)改變及功能異常，于1972年由Rubler等首次提出。臨床上，DCM通常表現(xiàn)為進行性左室肥厚及收縮和舒張功能障礙，其病理特點為心肌細胞肥大、凋亡，微血管病變及間質(zhì)纖維化等。DCM是一個長期而復雜的病理過程，它可以造成細胞代謝異常，進一步損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、肌原纖維等細胞

2、器，并最終導致心肌細胞肥大和凋亡的增加。而作為一種可調(diào)節(jié)的、耗能的細胞自殺機制，心肌細胞凋亡數(shù)量的增加又進一步加重了DCM過程中的心肌重構(gòu)與功能障礙。
　　 細胞凋亡本質(zhì)上是一種細胞的程序性死亡，它是指當機體處于生理或病理條件下，細胞啟動自身內(nèi)部機制，經(jīng)過多途徑的信號傳導，結(jié)束其自身生命的過程。細胞凋亡與細胞增殖相輔相成，共同調(diào)節(jié)著細胞群體的自我更新，維持機體的協(xié)調(diào)與平衡，保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在DCM的發(fā)病過程中，雖然疾病早期即存

3、在著心肌細胞的肥大、增殖和凋亡，但心臟功能尚可維持正常。隨著疾病的進一步發(fā)展，心肌細胞內(nèi)環(huán)境紊亂，細胞凋亡的程度遠遠超過了細胞增殖的速度，心肌細胞失去正常的調(diào)控，使得凋亡的范圍增大，速度加快，組織細胞大量喪失，最終導致心功能嚴重減退。細胞凋亡的調(diào)節(jié)機制包括一系列復雜的級聯(lián)反應，這其中最為重要的就是半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteineasparticacidspecificprotease，caspase)相關(guān)的凋亡信號轉(zhuǎn)導通路

4、，包括死亡受體介導的凋亡信號通路，線粒體/細胞色素c介導的凋亡通路和新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmicreticulumstress，ERS)介導的凋亡通路。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)是細胞內(nèi)一種極為重要的細胞器，其主要功能包括脂質(zhì)合成，蛋白質(zhì)折疊及鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。真核動物細胞中的大多數(shù)分泌蛋白和膜蛋白均需轉(zhuǎn)位至ER腔內(nèi)進行修飾和折疊。氧化應激、缺血、鈣穩(wěn)態(tài)的失衡等諸多因素均可影響ER

5、的功能，導致未折疊或錯誤折疊蛋白的蓄積，這一過程被稱之為ERS。ERS可進一步激活未折疊蛋白反應(unfoldingproteinresponse，UPR)，早期表現(xiàn)為抑制蛋白質(zhì)的翻譯和轉(zhuǎn)運，促進分子伴侶的表達，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解（ER-associateddegradation，ERAD），即將未折疊或錯誤折疊的蛋白逆轉(zhuǎn)回胞質(zhì)中，通過蛋白酶進行降解，以減少未折疊或錯誤折疊蛋白在ER的積聚，維持ER的正常功能。然而，當長期持續(xù)的應激或

6、刺激強度超過ER自身處理能力時，UPR便會啟動細胞凋亡信號，導致細胞凋亡的發(fā)生。而過度的凋亡使得機體細胞大量喪失，最終導致器官功能障礙。因此，ERS如同一把雙刃劍，在疾病的初始階段，它的激活可以促使細胞存活，延緩器官功能的損害;然而隨著疾病的進一步發(fā)展，若ERS介導的細胞凋亡失去了正常調(diào)控，便將導致組織細胞的過度丟失，加速器官功能的衰竭。
　　 X盒結(jié)合蛋白l(X-boxbindingprotein1，XBP1)是一種新發(fā)現(xiàn)的與

7、蛋白折疊及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)構(gòu)建相關(guān)的蛋白質(zhì)。它是亮氨酸拉鏈蛋白家族中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠與主要組織相容性復合物基因啟動子區(qū)域的X盒順式作用元件相結(jié)合，是ERS反應的關(guān)鍵信號調(diào)控因子。在ERS反應過程中，XBPlmRNA經(jīng)過需肌醇酶1(inositol-requiringkinase1，IREl)依賴性的剪接，使得具有261個氨基酸的未剪接型XBPl(X-boxbindingprotein-1unsplicing，XBP1-u)轉(zhuǎn)錄激活形成由3

8、76個氨基酸構(gòu)成的剪接型XBPl(X-boxbindingprotein-1splicing，XBP1-s)。XBP1-s所調(diào)控的ERS在疾病初期通?？梢源龠M細胞的生存，然而，隨著疾病的進一步發(fā)展，ERS長期持續(xù)激活最終將導致組織細胞過度凋亡。
　　 在DCM的病程中，高血糖、氧化應激、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等因素均可誘發(fā)ERS，進而導致心肌細胞的凋亡。然而，在這一病程中ERS誘導心肌細胞凋亡的機制尚未明確，XBP1在心肌細胞中的表達水平如

9、何，XBP1是否能夠通過介導ERS的激活參與心肌細胞的凋亡并發(fā)揮關(guān)鍵性的作用，這一系列問題目前國內(nèi)外尚缺乏相關(guān)的研究。
　　 纈沙坦是一種選擇性AT1受體拮抗劑，在臨床上被廣泛地應用于降低血壓和治療其他AngⅡ引起的心血管事件。近期研究表明纈沙坦除了具有降壓作用之外，還能夠通過增加血糖利用，降低鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的糖尿病大鼠的血糖水平。因此，本研究擬采用纈沙坦干預DCM大鼠，探討其改善DCM心

10、肌重構(gòu)的作用，并進一步研究纈沙坦的心肌保護作用與ERS的重要調(diào)控因子XBP1之間的聯(lián)系，旨在為臨床上DCM的防治提供全新的治療靶點和堅實的理論依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 1.構(gòu)建糖尿病大鼠模型，驗證DCM心肌重構(gòu)過程中存在ERS介導的心肌細胞凋亡的增加。
　　 2.探討DCM大鼠模型心肌組織中是否存在著XBP1的激活。
　　 3.探討XBP1與DCM大鼠心肌細胞凋亡之間的聯(lián)系。
　　 4.明確

11、纈沙坦逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)，尤其是抑制心肌細胞凋亡的作用與XBP1表達水平之間的聯(lián)系。
　　 研究方法：
　　 1.DCM動物模型的構(gòu)建
　　 第一階段:8周齡雄性Wistar大鼠(體重260～280g)50只，以標準大鼠飼料適應性喂養(yǎng)一周。隨后，隨機分為兩組:正常對照組10只，糖尿病組40只。糖尿病組大鼠腹腔注射STZ65mg/kg，正常對照組大鼠腹腔注射同等劑量的檸檬酸鹽緩沖液(PH4.5)。STZ腹腔注射7天后，收

12、集大鼠尾靜脈血測空腹血糖，以篩選成模糖尿病大鼠。糖尿病大鼠成模標準:連續(xù)2次空腹血糖≥16.7mmol/L（300mg/dl）。未達成模標準者予以剔除。
　　 第二階段:將已達糖尿病成模標準大鼠隨機分為2組:DCM組和DCM+纈沙坦組（30mg/kg/d）。正常對照組及DCM組大鼠予以生理鹽水灌胃。3組大鼠均再繼續(xù)喂養(yǎng)16周后處死取材。
　　 2.各組大鼠基本指標的監(jiān)測
　　 實驗過程中除常規(guī)每2周測1次體重和血

13、壓，每4周測1次空腹血糖外，分別于STZ注射后7日及實驗末抽取空腹尾靜脈血測定空腹血糖水平。
　　 3.超聲心動圖檢測
　　 分別于實驗開始時以及實驗末對各組進行常規(guī)超聲心動圖檢查，主要檢測以下指標:心率、左室舒張末期內(nèi)徑(leftventricularinternaldimensiondiastole，LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(leftventricularinternaldimensionsystole，LVI

14、Ds)、左室射血分數(shù)（leftventricularejectionfraction，LVEF）、E波最大速度、A波最大速度、E/A比值、E波減速時間(Edecelerationtime，EDT)、舒張末期左室后壁厚度（leftventricularposteriorwall，LVPW）、舒張末期室間隔厚度(interventricularseptumthickness，IVST)、短軸縮短率(fractionalshortening，

15、FS)、等容舒張時間(isovolumicrelaxationtime，IVRT)。
　　 4.心肌組織病理學檢測
　　 實驗結(jié)束處死動物后，進行取材、固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片，常規(guī)H&E染色、Masson三色染色以及天狼星紅染色，觀察心肌組織結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)、膠原分布情況。
　　 5.TUNEL染色
　　 使用TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（熒光法）對石蠟切片進行熒光染色，在熒光顯微鏡下觀

16、察，細胞核呈現(xiàn)綠色熒光的心肌細胞即為凋亡細胞，并進行統(tǒng)計分析。
　　 6.組織免疫熒光染色
　　 取心肌組織石蠟切片，對ERS標志性分子GRP78進行免疫熒光染色以證實ERS的發(fā)生。
　　 7.Westernblot檢測
　　 取-80℃保存的心肌組織，分別提取總蛋白和細胞核蛋白，通過10％～15％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodeeylsulfatepolyacrylamidegelel

17、ectrophoresis，SDS-PAGE)對等量的蛋白樣品進行分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗標記、顯色等，檢測分子伴侶糖調(diào)節(jié)蛋白（glucose-regulatedprotein78，GRP78）、C/EBP同源蛋白(C/EBPhomologousprotein，CHOP)、XBPI-s、p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(p53upregulatedmodulatorofapoptosis，Puma)、cleavedcaspase3和cyt

18、ochromec的表達。
　　 8.半定量RT-PCR和實時定量RT-PCR檢測
　　 Trizol法提取心肌組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得eDNA，以β-actin為參照，通過半定量RT-PCR技術(shù)檢測XBP1-smRNA水平的表達，實時定量RT-PCR技術(shù)檢測GRP78及CHOP的mRNA表達水平。
　　 9.統(tǒng)計學分析
　　 所用數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)值變量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示

19、，兩組間均數(shù)比較采用小樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用One-WayANOVA方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.實驗動物的基本情況
　　 實驗第一階段，糖尿病造模組中3只大鼠未達糖尿病成模標準，予以剔除，剩余37只大鼠達到糖尿病成模標準進入實驗下一階段。正常對照組狀態(tài)良好。實驗第二階段，5只罹患糖尿病的大鼠死亡，死亡原因可能與感染、糖尿病酮癥酸中毒及其他并發(fā)癥有關(guān)。最終共42

20、只大鼠完成實驗，其中正常對照組10只，DCM組15只，DCM+纈沙坦組17只。
　　 實驗過程中，正常對照組(n=10)大鼠精神狀態(tài)良好，體重明顯增加，反應敏捷，毛色白而光澤。DCM組(n=15)大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食和消瘦（三多一少）癥狀，體重增加遲緩甚至下降，精神萎靡，皮毛臟亂無光澤。DCM+纈沙坦治療組(n=17)大鼠一般狀態(tài)較DCM組相對略好。
　　 2.各組大鼠的基本指標監(jiān)測
　　 實驗初各組大鼠心率

21、、血糖、體重和血壓均無明顯差異(P＞0.05)。DCM大鼠自成模后多次測血糖，證明血糖水平始終維持在16.7mmol/L以上。實驗末DCM組與正常對照組相比，心率和體重隨著喂養(yǎng)時間的延長而明顯下降，血壓則隨著喂養(yǎng)時間的延長而升高(P＜0.05);DCM+纈沙坦組大鼠血糖和血壓較DCM組有所下降，心率及體重增加(P＜0.05)。
　　 3.超聲心動圖檢測
　　 分別于實驗初和實驗末通過超聲心動圖對各組大鼠各項指標進行檢測，

22、包括LVIDd、LVIDs、LVEF、E/A比值、FS、EDT’、IVRT’、IVS和LVPW。實驗初，實驗大鼠各項指標均無顯著差異(P＞0.05)。實驗末，DCM組大鼠較正常對照組LVIDd、LVIDs、IVST、LVPW和IVRT’明顯增加(P＜0.05)，EF、E/A比值下降，F(xiàn)S增加，EDT’增加(P＜0.05)，證明DCM組大鼠發(fā)生了心臟結(jié)構(gòu)及功能異常。DCM+纈沙坦組與DCM組相比，LVIDs、LVIDd、IVST、LVPW

23、和IVRT’有所下降(P＜0.05)，EF、E/A比值升高，F(xiàn)S下降，EDT’降低（P＜0.05），證明纈沙坦治療能夠有效改善心臟功能，抑制心肌重構(gòu)。
　　 4.心肌組織病理學檢查
　　 H&E染色:正常對照組心肌細胞排列整齊，大小均一，胞漿染色均勻;DCM組與正常對照組相比，心肌細胞肥大，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂;DCM+纈沙坦組與DCM組相比，細胞肥大減輕，排列較規(guī)則。
　　 Masson染色:正常對照組心肌膠原

24、纖維排列整齊，心肌小動脈周圍少量膠原沉積，心肌間質(zhì)內(nèi)少量膠原組織呈散在、長索條狀分布;DCM組與正常對照組相比，心肌細胞肥大，排列紊亂，心肌內(nèi)小血管周圍膠原沉積明顯增多，粗大膠原纖維交聯(lián)成網(wǎng)格狀;DCM+纈沙坦組與DCM組相比，心肌細胞排列較整齊，心肌間質(zhì)內(nèi)和小動脈周圍膠原纖維顯著減少。
　　 天狼星紅染色:DCM組與正常對照組相比，(I)型及(III)型膠原顯著增加;DCM+纈沙坦組與DCM組相比，膠原纖維含量有所下降。

25、>　　 5.DCM組心肌細胞凋亡增加并且纈沙坦能夠減少心肌細胞凋亡
　　 采用TUNEL染色檢測凋亡細胞，并通過Westemblot檢測凋亡標志性因子Puma、cleavedeaspase3和eytochromec的表達，觀察心肌細胞凋亡的水平。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，DCM組大鼠心肌細胞凋亡顯著增加(p＜0.05);DCM+纈沙坦組與DCM組相比，心肌細胞凋亡明顯減少（P＜0.05）。
　　 6.DCM大鼠心肌組

26、織中存在ERS的激活并且纈沙坦能夠抑制ERS的激活
　　 GRP78、CHOP是ERS激活的重要標志分子。通過組織免疫熒光法、Westernblot和實時定量RT-PCR檢測均顯示，正常對照組心肌組織中GRP78、CHOP僅有少量表達，而DCM組心肌GRP78、CHOP表達水平顯著上調(diào)(P＜0.05)，DCM+纈沙坦組與DCM組相比，心肌中GRP78、CHOP的表達水平有所下降（P＜0.05）。上述實驗結(jié)果從mRNA及蛋白水平上

27、證明了ERS在DCM心肌損害中被激活，而纈沙坦可以發(fā)揮抑制ERS激活的作用。
　　 7.DCM大鼠心肌組織中存在XBP1的激活并且纈沙坦可以抑制XBPl的活化
　　 半定量RT-PCR和Westernblot檢測顯示，與正常對照組相比，DCM組XBPl-s表達顯著增加(P＜0.05);DCM+纈沙坦組與DCM組相比，心肌組織中XBPl-s表達有所下調(diào)(P＜0.05)。上述實驗結(jié)果表明DCM心肌組織中存在XBP1的活化，而

28、纈沙坦治療可以抑制XBP1的激活。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過一次性注射STZ，成功構(gòu)建了DCM大鼠模型，為DCM發(fā)病機制的研究提供了可靠的動物模型。
　　 2.驗證了DCM病程中心肌重構(gòu)的存在，證明了心肌細胞凋亡的增加在DCM病程中發(fā)揮了重要作用。
　　 3.DCM心肌組織GRP78、CHOP表達上調(diào)，證實了DCM病程中存在ERS的激活。
　　 4.DCM心肌組織中存在ERS關(guān)鍵因子XBP1的

29、活化，證明DCM病程中存在著XBP1調(diào)控的ERS相關(guān)凋亡途徑的激活。
　　 5.纈沙坦能夠抑制DCM大鼠心肌細胞凋亡，改善心肌重構(gòu)，其作用靶點可能與抑制XBP1的激活有關(guān)。
　　 第二部分：論文ⅡXBP1在高糖誘導的心肌細胞凋亡中的作用及其信號轉(zhuǎn)導通路研究
　　 研究背景：
　　 糖尿病心肌病(diabeticcardiomyopathy，DCM)是糖尿病最重要的靶器官并發(fā)癥之一，以心肌細胞肥大、凋亡以及

30、間質(zhì)纖維化為主要病理特征。DCM疾病早期主要表現(xiàn)為心肌細胞肥大以及少量的心肌細胞凋亡;隨著疾病的發(fā)展，凋亡逐漸增多，使得心肌細胞數(shù)目大量減少，并最終加重DCM病程中的心肌重構(gòu)與功能障礙。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmicreticulumstress，ERS)過程中的未折疊蛋白反應(unfoldingproteinresponse，UPR)與糖尿病病程中葡萄糖、脂肪代謝紊亂存在著密切的聯(lián)系。當機體處于代謝障礙的狀態(tài)下，內(nèi)

31、質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)作為細胞蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成加工的主要場所，負荷劇增，觸發(fā)UPR，導致ERS的發(fā)生。ERS可能是糖脂代謝紊亂中尤為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，而葡萄糖利用障礙導致的心肌能量代謝紊亂是DCM心肌細胞凋亡的主要原因之一。因此，ERS可能在DCM心肌細胞凋亡過程中發(fā)揮了極其重要的作用。
　　 X盒結(jié)合蛋白l(X-boxbindingprotein1，XBP1)是調(diào)控ERS的關(guān)鍵分子。ERS時，XBP1

32、mRNA由ATF6誘導并經(jīng)IRE1特異性剪切，產(chǎn)生一種高活性轉(zhuǎn)錄因子XBP1-s，從而激活UPR。適度的ERS時，剪接后活化的XBP1能夠特異性的與未折疊蛋白反應元件（unfoldedproteinresponseelement，UPRE）結(jié)合，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解增強因子α甘露糖苷酶樣蛋白（ERdegradationenhancingα-mannosidase-likeprotein，EDEM）基因的轉(zhuǎn)錄，增強GRP78等分子伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄

33、活性，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解（ERassociateddegration，ERAD），促進未折疊和錯誤折疊糖蛋白的降解，從而促進了細胞的存活。然而，持續(xù)嚴重的ERS時，活化后的XBP1則與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激元件(ERstresselement，ERSE)相結(jié)合，激活相關(guān)的細胞凋亡信號。而C/EBP同源蛋白(C/EBPhomologousprotein，CHOP)作為C/EBP家族中堿性亮氨酸拉鏈蛋白(basicregionleucinezippe

34、r)的轉(zhuǎn)錄因子，它的啟動子恰好包含了至少兩種ERSE序列。因此，在DCM病程中，XBP1-s可能通過誘導轉(zhuǎn)錄因子CHOP的激活，導致心肌細胞的凋亡。
　　 CHOP在哺乳動物細胞中表達廣泛，參與細胞能量代謝、增殖、凋亡等多種病理生理過程。CHOP通路是ERS誘導細胞凋亡的三條主要通路之一，也是最為重要的ERS誘導細胞凋亡的通路。然而，XBP1-s和CHOP的表達均有組織特異性，并且隨刺激因素的不同其表達活性亦存在差異。在DCM心

35、肌組織中，是否存在XBP1-s和CHOP的表達上調(diào)，以及CHOP基因的轉(zhuǎn)錄激活是否與XBP1-s有關(guān)，目前國內(nèi)外尚缺乏相關(guān)研究。
　　 線粒體是細胞的能量工廠，也是調(diào)控細胞凋亡的最重要細胞器之一，而CHOP誘導的細胞凋亡可能是通過線粒體凋亡途徑實現(xiàn)的。線粒體依賴的凋亡途徑受Bcl-2家族成員的調(diào)控，p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(p53upregulatedmodulatorofapoptosis，Puma)是近年來發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族

36、BH3-only促凋亡蛋白成員。有研究發(fā)現(xiàn)Puma極有可能是聯(lián)系ERS和線粒體凋亡的重要因子。Puma通過直接或間接地與抑制凋亡的Bcl-2蛋白發(fā)生相互作用，解除Bcl-2/Bcl-xL對促凋亡的Bax/Bak蛋白的抑制作用，促使Bax/Bak構(gòu)象發(fā)生改變后在線粒體膜上形成寡聚物，導致線粒體膜通透性增加，線粒體內(nèi)的cytochromee釋放入胞質(zhì)，啟動caspase級聯(lián)反應，導致cleavedcaspase3表達上調(diào)，最終發(fā)生細胞凋亡。

37、生理狀態(tài)下，Puma的表達量非常低，而當諸如DNA損傷、ERS等多種應激刺激發(fā)生時，各種應激刺激通過p53依賴性和非依賴性的細胞凋亡途徑，誘導Puma的轉(zhuǎn)錄表達，進而調(diào)控線粒體凋亡途徑，導致細胞凋亡。有研究表明，ERS發(fā)生時，Puma表達相應上調(diào)，誘導細胞凋亡，提示ERS與Puma之間可能存在著一定的聯(lián)系。然而，在DCM病程中，ERS相關(guān)凋亡信號是否通過線粒體凋亡途徑介導心肌細胞凋亡？CHOP和Puma是否在這個過程中發(fā)揮了極為重要的橋

38、梁作用？這一系列問題仍有待進一步探討。
　　 基于以上討論，本課題提出以下假說:在DCM病程中，ERS通過激活XBP1，誘導CHOP基因的轉(zhuǎn)錄及表達上調(diào)，并進一步激活Puma介導的線粒體凋亡途徑，促進心肌細胞的凋亡。圍繞這一假說，本研究采用高糖刺激原代乳鼠心肌細胞誘導ERS的發(fā)生，探討XBP1、CHOP、Puma三種關(guān)鍵因子在ERS介導的心肌細胞凋亡過程中所發(fā)揮的作用及其三者之間可能存在的信號轉(zhuǎn)導機制，為闡明ERS介導心肌細胞凋

39、亡的相關(guān)通路提供全新的理論依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 1.驗證高糖誘導ERS介導心肌細胞凋亡的作用。
　　 2.探討XBP1、CHOP、Puma在ERS介導的心肌細胞凋亡過程中所發(fā)揮的作用。
　　 3.明確XBP1、CHOP、Puma三者之間可能存在的信號轉(zhuǎn)導機制。
　　 4.證實高糖刺激下，ERS可能通過XBP1/CHOP/Puma途徑誘導心肌細胞凋亡。
　　 研究方法：
　　

40、 1.原代乳鼠心肌細胞的培養(yǎng)
　　 取1～3天的Wistar新生乳鼠心臟，剪碎、胰酶消化、差速貼壁，獲取心肌細胞。生長至亞融合狀態(tài)，可觀察到心肌細胞搏動，進行原代心肌細胞培養(yǎng)。
　　 2.原代心肌細胞的鑒定
　　 采用肌鈣蛋白T單克隆抗體進行免疫熒光染色對原代培養(yǎng)的心肌細胞進行檢測，熒光顯微鏡下觀察、拍照。
　　 3.實驗設(shè)計
　　 在體外模擬糖尿病狀態(tài)，加入不同的刺激因素，研究心肌細胞干預后的

41、變化。對細胞分別進行以下處理:心肌細胞用一定濃度梯度的D-葡萄糖(5.5mmol/L、16.7mmol/L和33.3mmol/L)處理;心肌細胞用27.8mmol/L甘露醇+5.5mmol/LD-葡萄糖處理作為對照;高糖（33.3mmol/LD-葡萄糖）+XBPlsiRNA孵育細胞;高糖（33.3mmol/LD-葡萄糖）+CHOPsiRNA孵育細胞。
　　 4.小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)技

42、術(shù)
　　 采用siRNA技術(shù)分別抑制XBP1和CHOP的表達，觀察二者之間及其下游因子的表達變化。將提取的原代乳鼠心肌細胞分別用XBP1和CHOP的siRNA預處理24小時，再給予高糖刺激48h，收取細胞，通過流式細胞技術(shù)和Westernblot等技術(shù)檢測其下游因子的表達及細胞凋亡水平。
　　 5.流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡水平
　　 采用流式細胞技術(shù)檢測心肌細胞的凋亡情況，計算心肌細胞的凋亡率。
　　

43、6.Westernblot檢測
　　 收集細胞，提取總蛋白和細胞核蛋白，分別經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印記、顯色等步驟，檢測GRP78，XBP1-s，CHOP，Puma，cleavedcaspase3和cytochromec的表達。
　　 7.半定量RT-PCR和實時定量RT-PCR檢測
　　 收集細胞，提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應獲得eDNA，以β-actin作為參照，通過

44、半定量RT-PCR技術(shù)檢測XBP1-s的mRNA表達，實時定量RT-PCR技術(shù)檢測GRP78，CHOP和Puma的mRNA表達。
　　 研究結(jié)果：
　　 2.1.D-葡萄糖刺激心肌細胞凋亡呈現(xiàn)濃度梯度依賴性
　　 分別以低糖（含5.5mmol/LD-葡萄糖）、中糖（含16.7mmol/LD-葡萄糖）、高糖（含33.3mmol/LD-葡萄糖）和甘露醇（含27.8mmol/L甘露醇+5.5mmol/L的D-葡萄糖）刺

45、激心肌細胞48h，流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡情況，結(jié)果顯示中糖及高糖刺激組較低糖刺激組凋亡率明顯增加(P＜0.05);而甘露醇對照組的細胞凋亡率與低糖組相比未見明顯變化(P＞0.05)。由此可見，高濃度D-葡萄糖刺激可誘導心肌細胞凋亡，而刺激心肌細胞凋亡的最佳D-葡萄糖濃度為33.3mmol/L，刺激時間為48h。
　　 2.2.高糖刺激心肌細胞觸發(fā)ERS
　　 分別以低糖（含5.5mmol/LD-葡萄糖）、高糖（含33

46、.3mmol/LD-葡萄糖）和甘露醇（含27.8mmol/L甘露醇+5.5mmol/L的D-葡萄糖）刺激心肌細胞48h，收取三組細胞采用實時定量RT-PCR和Westemblot的方法進行檢測，結(jié)果顯示:高糖刺激組與低糖對照組相比，ERS的標志性因子GRP78mRNA和蛋白表達水平均上調(diào)(P＜0.05);而甘露醇對照組與低糖對照組相比，GRP78mRNA和蛋白表達水平未見明顯變化(P＞0.05)，說明高糖刺激心肌細胞能夠誘導ERS的發(fā)生

47、。
　　 2.3.高糖刺激導致心肌細胞凋亡過程中XBP1-s、CHOP和Puma的表達上調(diào)
　　 對低糖、高糖、甘露醇對照組細胞中XBP1-s、CHOP和Puma的表達進行半定量RT-PCR、實時定量RT-PCR和Westernblot檢測，結(jié)果顯示:高糖組與低糖對照組相比，XBP1活化因子XBP1-s、CHOP和Puma的mRNA和蛋白表達水平均上調(diào)(P＜0.05);而甘露醇對照組與低糖組相比，XBP1-s、CHOP和

48、Puma的mRNA和蛋白表達水平均未見明顯變化（P＞0.05）。
　　 同時，對各組中的凋亡因子cleavedcaspase3、cytochromec進行Westernblot檢測，結(jié)果顯示高糖組與低糖對照組相比，cleavedcaspase3、cytochromec表達顯著增加(P＜0.05);而甘露醇對照組與低糖組相比，cleavedcaspase3、cytochromec表達未見顯著變化（P＞0.05）。
　　 由

49、此可見高糖刺激能夠促使ERS關(guān)鍵因子XBP1，CHOP和Puma的表達上調(diào)，心肌細胞凋亡增加。上述實驗結(jié)果提示XBP1-s，CHOP和Puma在高糖刺激觸發(fā)ERS介導的心肌細胞凋亡這一過程中發(fā)揮著重要的作用。2.4XBP1siRNA及CHOPsiRNA可以抑制高糖刺激導致的心肌細胞凋亡
　　 (1)將原代培養(yǎng)的心肌細胞應用XBP1siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞24小時后，收取細胞并用半定量RT-PCR和Westernblot法驗證siR

50、NA的轉(zhuǎn)染效力，結(jié)果顯示:siRNA轉(zhuǎn)染組與對照組相比，XBP1的mRNA及蛋白表達水平顯著下調(diào)(P＜0.05)。上述結(jié)果提示XBP1siRNA能夠有效抑制XBP1的表達。
　　 (2)將原代培養(yǎng)的心肌細胞應用CHOPsiRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞24小時后，收取細胞并用實時定量RT-PCR及Westernblot法驗證siRNA的轉(zhuǎn)染效力，結(jié)果顯示:siRNA轉(zhuǎn)染組與對照組相比，CHOP的mRNA及蛋白表達水平顯著下調(diào)(P＜0.05)

51、。提示CHOPsiRNA能夠有效抑制CHOP的表達。
　　 (3)采用流式細胞技術(shù)對低糖組、高糖組、XBP1siRNA組和CHOPsiRNA組的細胞凋亡率進行檢測，結(jié)果顯示XBP1siRNA組與高糖組相比，心肌細胞凋亡率顯著降低(P＜0.05);CHOPsiRNA組與高糖組相比，心肌細胞凋亡率亦顯著降低（P＜0.05），證實XBP1siRNA及CHOPsiRNA可以抑制高糖刺激導致的心肌細胞凋亡，說明XBP1及CHOP在高糖誘導

52、的心肌細胞凋亡過程中發(fā)揮了重要的作用。
　　 2.5.高糖通過XBP1/CHOP/Puma通路介導心肌細胞凋亡
　　 本實驗中，我們采用siRNA技術(shù)抑制分別XBP1和CHOP的表達，觀察兩者分別抑制后XBP1-s、CHOP和Puma的表達情況。
　　 分別對低糖組、高糖組、XBPlsiRNA組（先應用XBP1siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞24小時后，再予以高糖刺激48小時）和CHOPsiRNA組（先應用CHOPsiRN

53、A轉(zhuǎn)染心肌細胞24小時后，再予以高糖刺激48小時）進行半定量RT-PCR、實時定量RT-PCR和Westernblot檢測。
　　 Westernblot的結(jié)果顯示:在應用了XBP1siRNA之后，XBP1-s蛋白表達顯著下調(diào)(P＜0.05);與此同時，CHOP和Puma的表達也伴隨著XBPl-s的表達減少而顯著下調(diào)(P＜0.05)，提示CHOP和Puma二者的表達受XBP1激活的調(diào)控，二者可能是XBP1的下游因子。在使用了CH

54、OPsiRNA之后，XBP1-s的表達未受到顯著影響(P＞0.05);與此同時，伴隨著CHOP表達的下調(diào)，Puma的表達也隨之下降(P＜0.05)，說明抑制CHOP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活對XBP1的表達無顯著影響，但對Puma的表達有顯著下調(diào)作用，這進一步提示CHOP是XBP1的下游因子，而Puma則更可能位于CHOP的下游。同時，通過半定量RT-PCR、實時定量RT-PCR檢測上述因子的mRNA表達水平，所得到的結(jié)論與上述蛋白檢測結(jié)果相吻合。

55、綜上所述，我們得出了XBP1、CHOP和Puma三者之間存在著上下游關(guān)系，XBP1/CHOP/Puma通路在高糖刺激觸發(fā)ERS所導致的心肌細胞凋亡過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.驗證了高糖刺激可以通過激活ERS進而誘導心肌細胞凋亡。
　　 2.首次證明XBP1在高糖刺激下ERS介導的心肌細胞凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 3.首次證明了高糖刺激下，XBP1/CHOP/Puma信號轉(zhuǎn)