內質網(wǎng)應激在糖尿病心肌病發(fā)病機制中作用的實驗研究.pdf

1、第一部分內質網(wǎng)應激與糖尿病心肌病心肌細胞凋亡關系的實驗 研究背景：有關內質網(wǎng)應激在糖尿病心肌病發(fā)病機制中的作用國內外尚無相關報道，明確兩者關系，在糖尿病心肌病的防治中將起到重要作用。 目的： 1.構建DCM動物模型。 2.探討DCM動物模型心臟重構及心功能改變情況。 3.明確內質網(wǎng)應激相關因子在DCM大鼠心肌內表達情況。 方法： 1.DCM動物模型構建雄性Wistar大鼠30只，隨

2、機分為2組：對照組10只，DCM組20只。標準大鼠飼料喂養(yǎng)1周后，禁食12h，DCM組大鼠給以腹腔內注射鏈脲佐菌素(STZ)65mg/kg，對照組大鼠注射等量檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖液。糖尿病大鼠成模的診斷標準為：連續(xù)2次空腹血糖≥16.7mmol/L。未達成模標準者剔除。DCM組大鼠血糖升高后，繼續(xù)喂養(yǎng)5個月，處死取材。 2.超聲心動圖檢測分別于糖尿病建模前、實驗末進行常規(guī)超聲心動圖檢查，測定如下指標：M型超聲心動圖測定左室收縮末

3、內徑、左室舒張末內徑、射血分數(shù)、短軸縮短率；彩色多普勒超聲心動圖觀察瓣膜返流情況；脈沖及連續(xù)多普勒超聲心動圖測定二尖瓣E波最大速度、A波最大速度、E/A比值、E波減速時間、等容舒張時間、主動脈血流最大速度。 3.心肌組織病理學檢查及Masson三色染色動物處死后，進行組織取材、固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，觀察心肌細胞形態(tài)并拍片；行Masson三色染色，觀察膠原分布形態(tài)并定量分析心肌組織膠原含量。

4、 4.TUNEL，染色發(fā)鑒定凋亡細胞取組織切片，進行TUNEL染色，觀察細胞凋亡水平。 5.實時定量RT-PCR法檢測分別從左室組織提取總RNA，經(jīng)逆轉錄反應(RT)得到cDNA，以GAPDH作為參照，通過real-time PCR技術檢測GRP78、Caspase 12、CHOP的表達。 6.免疫組織化學檢測取組織切片，進行GRP78免疫組織化學檢測，所用-抗為GRP78多克隆抗體(SantaCruz公司，1:400稀

5、釋)。 7.免疫印跡檢測取左室組織，提取總蛋白，經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉膜、蛋白印記、ECL顯色等步驟，檢測GRP78、Caspase12、p-JNK的蛋白表達。 結果： 1.實驗動物基本情況及血糖檢測實驗過程中，對照組大鼠精神狀態(tài)良好，體重增加明顯，反應敏捷，毛色白而光澤。DCM組大鼠出現(xiàn)多食、多飲、多尿和消瘦等癥狀，體重增加遲緩，精神萎靡，皮毛無光澤，部分出現(xiàn)爛尾、白內障等。

6、整個實驗過程中2只大鼠死亡，均為DCM組，死亡原因可能與糖尿病酮癥酸中毒、感染或其他相關并發(fā)癥有關。另有1只大鼠血糖未達成模標準，予以剔除。最終共27只完成實驗，其中對照組10只，DCM組17只。 注射STZ之前，對照組與DCM組血糖無明顯差異(P＞0.05)。注射STZ 1周后，DCM組血糖明顯高于對照組(P＜0.01)，并持續(xù)至實驗末。 2.超聲心動圖檢測實驗初，對照組及DCM組大鼠超聲心動圖檢測各項指標(包括LVI

7、Ds、LVIDd、EF、FS、瓣膜返流、E波最大速度、A波最大速度、E/A比值、EAT、EDT)無顯著性差異。實驗末，DCM組大鼠LVIDs及LVIDd明顯增加，房室瓣瓣膜返流發(fā)生率明顯增加，E波最大速度下降，A波最大速度增快，E/A比值下降，F(xiàn)S降低，APV降低，EDT無顯著性差異。 3.心肌組織病理學檢查及Masson三色染色HE染色切片上，對照組心肌細胞排列整齊，細胞核大小均一，胞漿染色均勻；DCM組心肌細胞排列紊亂，細胞

8、核大小不甚規(guī)則。 Masson三色染色：心肌細胞染色呈紅色，間質膠原呈藍綠色，紅細胞呈橘黃色。對照組心肌膠原組織分布均勻，DCM組心肌橫切面可見心肌內膠原組織明顯增多，粗大膠原纖維相互連接成網(wǎng)狀，排列紊亂，分布不勻，緊密圍繞于心肌細胞周圍及小血管周圍。定量分析顯示，左室心肌組織膠原含量在DCM組明顯高于對照組(P＜0.01)。 4. TUNEL染色法與對照組相比，糖尿病組大鼠心肌細胞凋亡明顯增加(P＜0.05)。

9、 5.實時定量RT-PCR法檢測與對照組相比，DCM組左室GRP78、CHOP及Caspase12的mRNA表達均明顯增高(P＜0.05)。 6.免疫組織化學檢測GRP78：對照組心肌組織內可見少量、分布均勻、稀疏的淺棕色顆粒，主要定位于心肌細胞及內皮細胞；DCM組心肌細胞胞漿內可見濃密的深棕色顆粒，同時內皮細胞亦見明顯表達。 7.免疫印跡檢測與對照組相比，DCM組左室組織蛋白GRP78、CHOP、Caspase12及p

10、-JNK表達均明顯增高(P＜0.05)。 結論： 1.通過腹腔注射STZ并喂養(yǎng)5個月，成功建立了糖尿病性心肌病大鼠模型，為DCM發(fā)病機制的研究提供了可靠的平臺； 2.心肌細胞凋亡增加、膠原組織沉積、心肌纖維化是DCM時的主要組織病理改變； 3.心臟舒張功能異常是DCM時的主要功能改變； 4.DCM大鼠心肌組織GRP78、CHOP、Caspase12及p-JNK表達增高，提示內質網(wǎng)應激導致的心肌細胞

11、凋亡在DCM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 第二部分高同型半胱氨酸血癥通過內質網(wǎng)應激途徑誘導心肌細胞凋亡的實驗 研究背景：同型半胱氨酸是一種具有毒性的非蛋白類含硫氨基酸，它在體內通過轉硫作用和去甲基作用被代謝。5-7％的人群中存在高同型半胱氨酸血癥。目前的證據(jù)表明HHcy是多種疾病獨立危險因素，這些疾病包括：動脈硬化，糖尿病，脂肪肝，以及神經(jīng)退行性變如帕金森綜合癥等。 有關Hcy能夠引起內質網(wǎng)應激的學說目前越來越受到

12、關注。內質網(wǎng)的生理功能包括蛋白質的合成、折疊和釋放以及鈣的貯存和調節(jié)，當內質網(wǎng)內錯誤折疊蛋白增多以至堆積時就會導致內質網(wǎng)應激，其中一個步驟就包括非折疊蛋白反應，后者是通過GRP78激活后續(xù)的信號通路最終引起細胞程序性死亡。Hcy能夠破壞蛋白在內質網(wǎng)內雙硫鍵的合成，造成蛋白的錯誤折疊，從而引起內質網(wǎng)應激反應。研究表明Hcy能夠引起多種內質網(wǎng)應激特異性的基因的表達，如GRP78，GRP94等，但是Hcy引起內質網(wǎng)應激在細胞內的靶點以及相關基

13、因的表達目前尚未清楚。 盡管HHcy已被認為是心血管疾病的獨立危險因素，并且HHcy與糖尿病心肌病的關系已得到證實，但多數(shù)研究集中關注在HHcy對內皮細胞和平滑肌的作用上，有關HHcy與糖尿病心肌病中心肌細胞凋亡之間的關系尚無相關報道，而細胞凋亡在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展中起到至關重要的作用。我們前一部分的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠的心肌內，有關內質網(wǎng)應激的相關因子如GRP78，Caspase12，p-JNK，CHOP均較正常大鼠表達

14、升高，提示內質網(wǎng)應激是導致糖尿病心肌病心肌細胞凋亡的機制之一；此外，我們對大鼠進行體內Hcy的檢測發(fā)現(xiàn)，隨著糖尿病病程的進展，大鼠體內總Hcy呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，最終出現(xiàn)HHcy。因此我們擬在本研究中，進行體外心肌細胞培養(yǎng)，以觀察HHcy對心肌細胞凋亡的影響，及與內質網(wǎng)應激的關系。 目的： 1.觀察同型半胱氨酸刺激是否能夠加速培養(yǎng)的心肌細胞凋亡。 2.觀察內質網(wǎng)應激途徑是否參與同型半胱氨酸誘導的心肌細胞凋亡

15、過程。方法1.心肌細胞的分離與培養(yǎng)無菌條件下取出Wistar乳鼠的心臟，剪碎,胰酶消化，差速貼壁去除成纖維細胞。生長至融合狀態(tài)，見明顯的心肌搏動，1:1傳代，采用2-3代心肌細胞進行實驗。 2.實驗設計 1)培養(yǎng)的心肌細胞分別加入不同濃度的同型半胱氨酸(0.025、0.1、1mM)刺激，后進行TUNEL染色判斷心肌細胞凋亡情況。并甄選出最佳同型半胱氨酸刺激濃度。 2)將培養(yǎng)的心肌細胞給予同型半胱氨酸刺激后收集，分

16、別測定GRP78，Caspase12，CHOP及p-JNK的表達水平。 3.TUNEL法測定心肌細胞的凋亡水平將培養(yǎng)的心肌細胞固定，后進行TUNEL染色，測定心肌細胞的凋亡水平。 4.實時定量RT-PCR檢測GRP78，Caspase12及CHOP的mRNA表達將所收集的細胞提取總RNA，經(jīng)逆轉錄反應得到cDNA，以GAPDH作為參照，通過RT-PCR技術檢測GRP78，Caspase12及CHOP的mRNA表達。

17、 5.Western blot檢測GRP78，Caspase12，CHOP及p-JNK的蛋白表達將所收集的細胞提取總蛋白，經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉膜、蛋白印記、熒光顯色等步驟，檢測GRP78，Caspase12，CHOP及p-JNK的蛋白表達情況。 結果： 1.同型半胱氨酸對培養(yǎng)心肌細胞凋亡水平的影響TUNEL染色顯示，與正常組對照，經(jīng)過同型半胱氨酸刺激的心肌細胞的凋亡水平明顯增高，并