內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在糖尿病腎損害過程中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥，在DN發(fā)展過程中，腎臟固有細(xì)胞過度凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞增殖與凋亡關(guān)系的不平衡是腎功能惡化甚至衰竭的重要機(jī)制之一。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是細(xì)胞內(nèi)蛋白合成后修飾、折疊的重要場(chǎng)所，對(duì)維持細(xì)胞正常功能具有重要作用。然而ER對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的環(huán)境變化非常敏感，Ca2+的耗竭、

2、缺血、缺氧、錯(cuò)誤折疊及未折疊蛋白在腔內(nèi)的聚集等均可干擾ER功能，繼而促發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS激活多種信號(hào)途徑，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和生存，稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded proteinresponse，UPR)，UPR的重要途徑之一是通過上調(diào)ER中分子伴侶蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)ER蛋白折疊能力。78kd-糖調(diào)節(jié)蛋白（78-kd glucose-regulatedprot

3、ein，GRP78）是UPR網(wǎng)絡(luò)的中心調(diào)節(jié)蛋白，通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件PKR、IRE1以及ATF6的結(jié)合抑制ERS的激活。因此早期的UPR及時(shí)有效的逆轉(zhuǎn)ERS增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力，是在適度ERS下細(xì)胞啟動(dòng)的一種適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制。但嚴(yán)重而持久的應(yīng)激超過細(xì)胞自身修復(fù)能力，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)不能及時(shí)恢復(fù)，凋亡將是細(xì)胞的最終結(jié)局。盡管ERS介導(dǎo)的凋亡途徑并沒有完全闡明，但2個(gè)標(biāo)志性蛋白（促凋亡轉(zhuǎn)錄因子GADD153/CHOP的激活和位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的特有的ca

4、spase-12途徑）已經(jīng)被確認(rèn)參與這個(gè)過程，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡(ER-associated death，ERAD)途徑。
　　 足細(xì)胞是腎小球內(nèi)一種獨(dú)特的、終末分化的上皮細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)含有較發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體等細(xì)胞器，是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分。近年研究顯示以足細(xì)胞凋亡為主造成細(xì)胞數(shù)目減少在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡途徑是否與糖尿病腎病中足細(xì)胞的凋亡有關(guān)尚不完全清楚。
　　 本實(shí)

5、驗(yàn)擬從觀察大鼠糖尿病模型腎組織及高糖培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞中凋亡程度，ERS相關(guān)蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)和定位入手，探討ERS在糖尿病腎足細(xì)胞凋亡發(fā)生中的可能作用；并研究ERS與傳統(tǒng)線粒體凋亡途徑之間的關(guān)系，以便更深入的了解DM腎損傷的潛在分子機(jī)制；同時(shí)，應(yīng)用特異的UPR反應(yīng)誘導(dǎo)劑衣霉素進(jìn)行預(yù)干預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察靶向ERS是否能延緩或改善糖尿病腎組織及足細(xì)胞損傷的病理進(jìn)展過程，為疾病治療方案的全新設(shè)計(jì)提供新思路。
　　 方法：
　　 1.大鼠

6、糖尿病模型腎組織及高糖培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞中細(xì)胞凋亡及GRP78，GADD153/CHOP和Caspase-12的檢測(cè)
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：
　　 雄性Wistar大鼠行右腎切除術(shù)后2w，以腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素(65mg/kg)制備大鼠糖尿病模型，對(duì)照組只注射相當(dāng)體積的枸櫞酸鹽緩沖液；48h后尾尖取血，血糖儀測(cè)定血糖，尿糖試紙測(cè)定尿糖，血糖≥16.7mmol/L，尿糖+++～++++者確定為DM模型。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲

7、水，不使用胰島素及其他降糖藥物。對(duì)照組及糖尿病組于注射STZ后2w、4w、8w、12w每組取6只大鼠，收集血、尿標(biāo)本用于生化指標(biāo)測(cè)定；切取腎臟分別置于4％多聚甲醛(0.01mol/L PBS配制)、4％戊二醛及70％乙醇固定，用于光鏡、透射電鏡觀察、免疫組化、TUNEL及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；部分腎皮質(zhì)經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于Westernblot檢測(cè)。
　　 體外實(shí)驗(yàn)：
　　 1)小鼠足細(xì)胞的培養(yǎng)
　　

8、復(fù)蘇細(xì)胞后，以含10％胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，2-3滴小鼠γ-干擾素的DMEM-F12培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)室5％CO2，33℃CO2培養(yǎng)箱中保持細(xì)胞增殖狀態(tài)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶瓶底的80％左右即可進(jìn)行消化傳代；傳代后更換10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素DMEM-F12培養(yǎng)液置入5％CO2，37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，期間2～3天更換培養(yǎng)液一次，相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)速

9、度減慢，細(xì)胞體積明顯增大，向四周伸出足突誘導(dǎo)成熟分化后用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2)小鼠足細(xì)胞分組及相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)
　　 將分化成熟的足細(xì)胞分成3組：正常糖對(duì)照組(NG):D-葡萄糖1g/L；高糖刺激組(HG):D-葡萄糖4.5g/L；高糖+AngⅡ刺激組(HG+AngⅡ):D-葡萄糖4.5g/L+AngⅡ10-8mol/L。分別經(jīng)細(xì)胞同步化、分組干預(yù)及刺激12、24、48、72h后收集細(xì)胞，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；TUN

10、EL法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；免疫細(xì)胞化學(xué)、Western blot和RT-PCR檢測(cè)GRP78、Caspase-12、GADD153/CHOP蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　 2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理對(duì)大鼠糖尿病腎組織及高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞凋亡中的影響及相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)
　　 將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組(N組)和糖尿病組(DM)和衣霉素處理組(ATM)：分為ATM1組(成膜前1w一次性腹腔注射衣霉素，0.2mg

11、/kg)；ATM2組(成膜1w一次性腹腔注射衣霉素，0.2mg/kg)，于注射STZ后4w及12w處死動(dòng)物，收集血、尿及腎組織，分別進(jìn)行血、尿生化指標(biāo)檢測(cè)；透射電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)改變、TUNEL及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎組織細(xì)胞凋亡發(fā)生情況；免疫組織化學(xué)及Western blot檢測(cè)腎皮質(zhì)中GRP78、Caspase-12、GADD153/CHOP蛋白表達(dá)變化。
　　 體外實(shí)驗(yàn)：
　　 將分化成熟的小鼠足細(xì)胞分成3組：正常糖

12、對(duì)照組(NG)：D-葡萄糖1g/L;高糖刺激組(HG)：D-葡萄糖4.5g/L；衣霉素干預(yù)組(CTM)：衣霉素0.1μg/ml+D-葡萄糖4.5g/L，分別經(jīng)細(xì)胞同步化、分組干預(yù)及刺激24、72h收集細(xì)胞，透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)變化、免疫細(xì)胞化學(xué)、westernblot檢測(cè)GRP78、Caspase-12、GADD153/CHOP蛋白的表達(dá)。
　　 3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理劑衣霉素對(duì)高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中傳統(tǒng)線粒體凋亡途徑的影響及相關(guān)指標(biāo)

13、的檢測(cè)
　　 將分化成熟的小鼠足細(xì)胞分成3組：正常糖對(duì)照組(NG)：D-葡萄糖1g/L、高糖刺激組(HG):D-葡萄糖4.5g/L和衣霉素干預(yù)組(CTM):衣霉素0.1μg/ml+D-葡萄糖4.5g/L。分別經(jīng)細(xì)胞同步化、分組干預(yù)及刺激72h后收集細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體跨膜電位：免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測(cè)足細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)變化；Western blot檢測(cè)Cytochrome C蛋白的表達(dá)變

14、化。
　　 結(jié)果：
　　 1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)糖尿病大鼠腎組織固有細(xì)胞和高糖培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞的凋亡
　　 體內(nèi)試驗(yàn)：
　　 ①光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：糖尿病組腎小球體積增大，系膜基質(zhì)增多，部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性；②透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：糖尿病組腎小球基底膜不規(guī)則增厚，足細(xì)胞部分足突融合，近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡。腎小管上皮細(xì)胞及足細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可見顆粒融合及脫顆粒現(xiàn)象，線粒體部分嵴消失，嵴膜明顯融

15、合；③TUNEL結(jié)果顯示，正常對(duì)照組鮮有凋亡細(xì)胞，糖尿病組細(xì)胞凋亡數(shù)自2w起即明顯增多，主要見于腎皮質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞，尤以皮髓質(zhì)交界處多見，4w起腎小球內(nèi)可見凋亡細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示糖尿病腎組織中細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯升高，且呈時(shí)間依賴性；④免疫組織化學(xué)結(jié)果：GRP78在正常對(duì)照組呈弱表達(dá)，主要定位于遠(yuǎn)端小管和集合管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，與之相比，糖尿病組GRP78的表達(dá)明顯增強(qiáng)，尤以近曲小管胞漿最為顯著，4周起，部分腎小球內(nèi)細(xì)胞胞漿也呈

16、陽性表達(dá)，之后表達(dá)逐漸減弱；Caspase-12正常對(duì)照組表達(dá)較弱，主要位于腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，糖尿病組表達(dá)明顯增強(qiáng)，近曲小管及小球固有細(xì)胞的胞漿內(nèi)均可見陽性表達(dá)；GADD153/CHOP正常組表達(dá)主要位于小管上皮的胞漿內(nèi)，個(gè)別細(xì)胞核呈陽性，糖尿病組腎小管、腎小球固有細(xì)胞胞漿胞核均有表達(dá)，細(xì)胞核陽性表達(dá)的細(xì)胞主要位于近端小管上皮細(xì)胞及部分腎小球，尤其在皮髓質(zhì)交界的部位，較正常對(duì)照組明顯增多；⑤Western blot結(jié)果：糖尿病組GR

17、P78自2w起表達(dá)即高于對(duì)照組，4w表達(dá)達(dá)高峰，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸下降，12w基本降至正常水平；Caspase-12自4w開始表達(dá)高于對(duì)照組，并隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增高；GADD153/CHOP核蛋白在糖尿病組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均高于對(duì)照組，8w達(dá)高峰，12w表達(dá)略下降。
　　 體外實(shí)驗(yàn)：
　　 ①透射電鏡結(jié)果顯示，正常足細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，可見少許微絨毛、細(xì)小突起。高糖刺激下，足細(xì)胞絨毛及突起增多，細(xì)胞內(nèi)可見大量空泡，線粒體

18、及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見形態(tài)學(xué)改變，高糖+AngⅡ刺激組足細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變與高糖組大致相同；②流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL法結(jié)果均顯示：高糖刺激組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于對(duì)照組，而高糖+AngⅡ刺激組細(xì)胞凋亡率較高糖刺激組進(jìn)一步升高，呈時(shí)間依賴性；③免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：對(duì)照組GRP78、GADD153/CHOP、Caspase-12均有少量陽性表達(dá)，高糖刺激后，足細(xì)胞內(nèi)這三種蛋白陽性表達(dá)均明顯增強(qiáng)，高糖+AngⅡ刺激組較高糖組表達(dá)進(jìn)一步增高；④Western bl

19、ot結(jié)果：高糖刺激組GRP78、Caspase-12、GADD153/CHOP表達(dá)較正常對(duì)照組增高，GRP78在24h達(dá)高峰，之后呈下降趨勢(shì)，72h基本降至正常水平；Caspase-12隨時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增高，GADD153/CHOP核蛋白表達(dá)于48h最高，72h表達(dá)略下降。高糖+AngⅡ刺激組這三者表達(dá)較高糖組進(jìn)一步升高，趨勢(shì)大致相同；⑤RT-PCR結(jié)果：高糖刺激組GRP78、Caspase-12、GADD153/CHOP的mRNA

20、水平表達(dá)較正常對(duì)照組增高，趨勢(shì)與Western blot結(jié)果大致相同，高糖+AngⅡ刺激組這三者表達(dá)較高糖組進(jìn)一步升高。
　　 2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理劑衣霉素對(duì)大鼠糖尿病腎組織及高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞凋亡及相關(guān)指標(biāo)的影響
　　 適宜劑量UPR誘導(dǎo)劑衣霉素預(yù)處理通過上調(diào)了UPR中心調(diào)解蛋白GRP78的表達(dá)，抑制了ERS相關(guān)凋亡信號(hào)途徑GADD153/CHOP、Caspase-12的激活，減少細(xì)胞的凋亡率，改善糖尿病大鼠腎損害程度及

21、足細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)變化
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：①光鏡下觀察，ATM1和ATM2組組腎組織病理變化于12w時(shí)較糖尿病組有所改善；②透射電鏡觀察，糖尿病組改變同前所述，ATM1組和ATM2組4w時(shí)基底膜輕度增厚，足突個(gè)別融合，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可見顆粒融合及脫顆?，F(xiàn)象，12w時(shí)，基底膜及足細(xì)胞足突病變較糖尿病組明顯減輕，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)也有明顯改善，線粒體部分嵴膜融合，模糊不清；③流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL法檢測(cè)結(jié)果均顯示：ATM1組和ATM2組凋亡細(xì)胞數(shù)

22、或凋亡率明顯低于糖尿病組，但仍高于正常對(duì)照組。④免疫組織化學(xué)結(jié)果：ATM1組和ATM2組GRP78的表達(dá)較糖尿病組進(jìn)一步增高，GADD153/CHOP、Caspase-12的表達(dá)于4w時(shí)與糖尿病組相比無明顯差異，12w時(shí)，表達(dá)較糖尿病組有所下降，但仍高于正常對(duì)照組；⑤Western blot結(jié)果：ATM1組和ATM2組GRP78的表達(dá)較糖尿病組進(jìn)一步增高，GADD153/CHOP、Caspase-12的表達(dá)于4w時(shí)與糖尿病組相比差異無統(tǒng)

23、計(jì)學(xué)意義，12w時(shí)，表達(dá)較糖尿病組有所下降，但仍高于正常對(duì)照組。
　　 體外實(shí)驗(yàn)：
　　 ①透射電鏡結(jié)果顯示：CTM2組足細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變較糖尿病組有所減輕；②流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL法結(jié)果顯示：CTM2組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯低于高糖刺激組，但仍高于正常對(duì)照組，CTM1組凋亡率與高糖刺激組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CTM3組凋亡細(xì)胞數(shù)較高糖刺激組大大增高；③免疫組織化學(xué)結(jié)果：CTM2組GRP78表達(dá)較高糖組有所增加，Caspase-12、

24、GADD153/CHOP表達(dá)較高糖組減弱，但均高于正常糖對(duì)照組；④Western blot結(jié)果：CTM2組GRP78于24h表達(dá)最強(qiáng)，之后呈下降趨勢(shì)，但表達(dá)始終高于高糖刺激組。Caspase-12、GADD153/CHOP72h時(shí)較高糖刺激組表達(dá)明顯減弱。
　　 3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理劑衣霉素對(duì)高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞傳統(tǒng)線粒體凋亡途徑相關(guān)指標(biāo)的影響
　　 ①足細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrial tranmembrane

25、 pitentials，ΔΨm）的改變：高糖刺激組較正常對(duì)照組ΔΨm明顯下降，CTM刺激組較高糖對(duì)照組明顯升高，但較正常對(duì)照組降低。②免疫組化結(jié)果：對(duì)照組足細(xì)胞Caspase-3有少量陽性表達(dá)，高糖刺激后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，CTM刺激組蛋白表達(dá)較高糖組顯著降低。③Western blot結(jié)果：高糖刺激組Cytochrome C、Caspase-3表達(dá)較正常對(duì)照組增高，CTM刺激組蛋白表達(dá)較高糖組顯著降低。

26、　　 結(jié)論：
　　 1.糖尿病大鼠腎損害及高糖刺激對(duì)足細(xì)胞的損害過程中誘導(dǎo)了ERS，其相關(guān)凋亡途徑參與了腎臟固有細(xì)胞凋亡，并在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　 2.適宜劑量的UPR誘導(dǎo)劑衣霉素預(yù)處理糖尿病大鼠及高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞，顯著減少了細(xì)胞的凋亡率，增強(qiáng)了細(xì)胞的存活能力，對(duì)組織細(xì)胞具有保護(hù)作用。但UPR是雙刃劍，衣霉素的這種保護(hù)作用與它的濃度有關(guān)，過強(qiáng)的激活ERS，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的損害直至凋亡。
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