脂聯(lián)素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致血管鈣化過程中的作用及其機(jī)制.pdf

1、脂聯(lián)素（Adiponectin，APN）是由脂肪細(xì)胞所分泌的，是一種特異性的脂肪細(xì)胞因子，是調(diào)節(jié)機(jī)體代謝的因子之一，APN具有抗糖尿病、抗炎、抗纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，同時(shí)具有保護(hù)血管的生理效應(yīng)。近年來國內(nèi)外的多項(xiàng)研究表明，APN可以通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、抑制ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)等多種途徑發(fā)揮血管的保護(hù)作用，但其具體機(jī)制還有待于深入研究。本研究通過建立離體、在體鈣化模型，結(jié)合病理分析、分子生物學(xué)及細(xì)胞生物

2、學(xué)等技術(shù)，闡述APN通過減輕ERS所致的細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕血管鈣化的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)：
　　第一部分脂聯(lián)素對(duì)大鼠血管鈣化的抑制作用
　　目的：
　　構(gòu)建大鼠鈣化模型，觀察APN對(duì)大鼠血管鈣化的抑制作用。
　　方法：
　　健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組各10只。分別為正常對(duì)照組（sham組）：給予等量的生理鹽水肌注和單純花生油灌胃；鈣化組（VDN組）：第一天8時(shí)維生素D3（300000U/kg）肌肉

3、注射，尼古丁（25mg/kg）溶于花生油中進(jìn)行灌胃（8時(shí)和18時(shí)各一次），第二天起以等量的蒸餾水灌胃；鈣化+脂聯(lián)素（globular Adiponectin，gAd）組（VDN+gAd組）：模型制作同鈣化組，同時(shí)舌靜脈注射gAd(1μg·kg-1/日)。三組動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)6周后稱重，用2％戊巴比妥鈉麻醉，摘取胸主動(dòng)脈，結(jié)合病理分析（血管組織Von Kossa染色觀察血管鈣化程度）、胸主動(dòng)脈鈣含量和ALP活性測定觀察鈣化程度、Real-ti

4、me PCR和Western blot檢測血管平滑肌組織鈣化指標(biāo)OPG、Runx2的基因和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　（1）Von Kossa染色顯示sham組未見鈣質(zhì)沉積，VDN組血管可見明顯的黑色顆粒鈣質(zhì)沉積、部分中膜彈力纖維紊亂斷裂，VDN+gAd組僅可見少量黑色顆粒鈣質(zhì)沉積；與sham組相比，VDN組鈣含量和ALP活性明顯增高（P＜0.01)，VDN+gAd組與VDN組相比，鈣含量和ALP活性明顯降低（P＜0.05)

5、。（2）與sham組相比，VDN組OPG mRNA表達(dá)明顯減少，Runx2mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.01)；VDN+gAd組與VDN組相比，OPG mRNA表達(dá)明顯增加，Runx2mRNA表達(dá)明顯減少（P＜0.01)。（3）與sham組相比，VDN組OPG蛋白表達(dá)明顯減少，Runx2蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01)；VDN+gAd組與VDN組相比，OPG蛋白表達(dá)明顯增加，Runx2蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.01)，提示gAd可明顯逆

6、轉(zhuǎn)Runx2蛋白表達(dá)的上調(diào)，脂聯(lián)素可以減輕血管鈣化。
　　結(jié)論：
　　gAd對(duì)大鼠血管鈣化有抑制作用。
　　第二部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡促進(jìn)血管鈣化
　　目的：
　　采用原代培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞制備鈣化模型，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡對(duì)血管鈣化的促進(jìn)作用。
　　方法：
　　原代培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC，制備鈣化模型，隨機(jī)分為4組：
　　a.VSMC+正常培養(yǎng)（control組）
　

7、　b.VSMC+β-甘油磷酸鈉（β-GP組）
　　c.VSMC+TG+β-甘油磷酸鈉（TG組）
　　d.VSMC+4-PBA+β-甘油磷酸鈉（4-PBA組）
　　結(jié)合Von Kossa染色觀察細(xì)胞鈣化、采用細(xì)胞鈣含量和ALP活性測定觀察細(xì)胞鈣化程度、TUNEL法和Caspase3活性測定評(píng)估VSMC凋亡情況、Real-time PCR和Western blot檢測VSMC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、鈣化相關(guān)指標(biāo)（GRP78、

8、caspase12、CHOP、OPG、Runx2）的基因和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）Von Kossa染色顯示細(xì)胞鈣化模型成功制備；與control組相比，β-GP組和TG組鈣含量與ALP活性顯著增高(P＜0.01)，4-PBA組鈣含量與ALP活性明顯增高(P＜0.05)；TG組與β-GP組相比，鈣含量與ALP活性明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；4-PBA組與β-GP組相比，鈣含量與ALP活性明顯降低，差

9、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　?。?）control組偶見TUNEL陽性細(xì)胞，與control組相比，β-GP組、TG組TUNEL陽性細(xì)胞明顯增多（P＜0.01），caspase3活性顯著升高（P＜0.01），4-PBA組TUNEL陽性細(xì)胞明顯增多、caspase3活性明顯升高（分別P＜0.05）；TG組凋亡細(xì)胞較β-GP組明顯增多，caspase3活性明顯升高(分別P＜0.05)，4-PBA組較β-GP組TUNEL陽性細(xì)胞

10、顯著減少、caspase3活性顯著降低（P＜0.05）。
　　（3）與control組相比，β-GP組和TG組GRP78、CHOP、caspase12及Runx2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，OPGmRNA和蛋白表達(dá)顯著減少（分別P＜0.01）；TG組與β-GP組相比，GRP78、CHOP、 caspase12及Runx2mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，OPGmRNA和蛋白表達(dá)顯著減少（分別P＜0.05），4-PBA組與β-GP組相比

11、， GRP78、CHOP、caspase12及Runx2mRNA和蛋白表達(dá)明顯被抑制，OPGmRNA和蛋白表達(dá)顯著增加（分別P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡促進(jìn)血管鈣化。
　　第三部分脂聯(lián)素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致細(xì)胞凋亡導(dǎo)致血管鈣化中的作用
　　(一)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討脂聯(lián)素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致細(xì)胞凋亡導(dǎo)致血管鈣化中的作用
　　目的：
　　采用在體大鼠血管鈣化模型，探討脂聯(lián)素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致細(xì)胞凋

12、亡導(dǎo)致血管鈣化中的作用。
　　方法：
　　健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組各10只，實(shí)驗(yàn)分組同實(shí)驗(yàn)一。采用胸主動(dòng)脈鈣含量和ALP活性測定觀察鈣化程度、TUNEL法和Caspase3活性測定評(píng)估VSMC凋亡情況、Real-time PCR和Western blot檢測血管平滑肌組織ERS、細(xì)胞凋亡、鈣化相關(guān)指標(biāo)（GRP78、Caspase12、CHOP、OPG、Runx2）的基因和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　（1

13、）與sham組相比，VDN組鈣含量和ALP活性明顯增高（P＜0.01），VDN+gAd組與VDN組相比，其鈣含量和ALP活性明顯降低（P＜0.05），提示外源性給予脂聯(lián)素后，血管鈣化明顯減輕。
　?。?）sham組極少見TUNEL陽性細(xì)胞，與sham組相比，VDN組和VDN+gAd組TUNEL陽性細(xì)胞顯著增多、caspase3活性顯著升高（分別P<0.01），VDN+gAd組較VDN組TUNEL陽性細(xì)胞顯著減少、caspase3活

14、性顯著降低（分別P<0.05），提示外源性給予脂聯(lián)素后，平滑肌細(xì)胞凋亡明顯減少。
　?。?）與sham組相比，VDN組Caspase12、CHOP、GRP78及Runx2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加、OPGmRNA和蛋白表達(dá)顯著減少（分別P<0.01），給予脂聯(lián)素處理后，GRP78、CHOP、caspase12及Runx2mRNA和蛋白表達(dá)明顯被抑制，OPGmRNA和蛋白表達(dá)顯著增高（P<0.05），提示gAd處理后可明顯逆轉(zhuǎn)GR

15、P78、CHOP、caspase12及Runx2mRNA和蛋白表達(dá)的上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　gAd可減輕大鼠血管鈣化，與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　（二）細(xì)胞水平驗(yàn)證脂聯(lián)素抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡減輕血管鈣化
　　目的：
　　采用離體原代培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC鈣化模型，驗(yàn)證脂聯(lián)素通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡減輕血管鈣化。
　　方法：
　　原代培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC，隨機(jī)分為6

16、組：
　　a.control組
　　b.gAd（2μg/ml）組
　　c.β-GP組
　　d.β-GP+gAd（0.5μg/ml）組
　　e.β-GP+gAd（1μg/ml）組
　　f.β-GP+gAd（2μg/ml）組
　　采用細(xì)胞鈣含量和ALP活性測定判斷細(xì)胞鈣化程度、TUNEL法和Caspase3活性測定評(píng)估VSMC凋亡情況、Real-time PCR和Western blot檢測VSMC

17、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、鈣化相關(guān)指標(biāo)（GRP78、caspase12、CHOP、OPG、Runx2）的基因和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）β-GP組鈣含量和ALP活性與control組相比差異性顯著（P<0.01），與β-GP組相比，β-GP+gAd1μg/ml組、β-GP+gAd2μg/ml組鈣含量與ALP活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別P<0.05）。
　?。?）control組及gAd組偶見細(xì)胞凋亡，β-

18、GP組TUNEL陽性細(xì)胞明顯增多、caspase3活性顯著升高；與β-GP組相比，β-GP+gAd1μg/ml組、β-GP+gAd2μg/ml組TUNEL陽性細(xì)胞明顯降低，caspase3活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　（3）與control組相比，β-GP組和β-GP+gAd0.5μg/ml組GRP78、CHOP、caspase12及Runx2mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，OPGmRNA和蛋白表達(dá)顯著降低（分

19、別P<0.01）；與β-GP組相比，β-GP+gAd1μg/ml組、β-GP+gAd2μg/ml組GRP78、CHOP、caspase12及Runx2mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，OPGmRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示外源性給予gAd可以減輕平滑肌細(xì)胞鈣化。其中以2μg/ml的濃度為佳，說明gAd的血管保護(hù)作用具有濃度依賴性。
　　結(jié)論：
　　gAd可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而減輕平滑