血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制研究.pdf

1、心肌肥大是由缺血、機械牽張、激素和細胞因子等因素引起的心肌細胞代償性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為細胞體積增大、重量增加以及間質(zhì)細胞增生，其過程中必然伴隨著鈣穩(wěn)態(tài)的失衡、蛋白質(zhì)合成速率增加以及細胞凋亡。心肌肥大失代償時出現(xiàn)心力衰竭，嚴重危及人類生命。因此闡明心肌肥大的發(fā)病機制具有重要的臨床意義。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)是細胞內(nèi)重要的亞細胞器，參與蛋白質(zhì)合成、折疊、鈣的儲存和釋放，還參與脂類代謝、類固醇代

2、謝的合成，對維持心肌細胞鈣離子和蛋白質(zhì)合成穩(wěn)態(tài)具有重要作用。缺血缺氧、葡萄糖/營養(yǎng)物質(zhì)匱乏、ATP耗竭、大量自由基的產(chǎn)生及Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等應(yīng)激刺激均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERstress，ERS)。適度的ER應(yīng)激有利于細胞內(nèi)鈣和蛋白質(zhì)加工等穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)，增強細胞耐受應(yīng)激刺激的能力;持續(xù)而嚴重的ER應(yīng)激則促進CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-bindingprotein-homologous

3、protein，CHOP)和Caspase-12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路激活，觸發(fā)ER應(yīng)激相關(guān)的凋亡信號通路，導(dǎo)致細胞凋亡。ER應(yīng)激感受蛋白——蛋白激酶R樣ER激酶(proteinkinaseR-likeERkinase，PERK)是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白激酶。正常狀態(tài)下，PERK與GRP78結(jié)合成無活性的復(fù)合物;當(dāng)發(fā)生ER應(yīng)激時，GRP78與未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白結(jié)合，同時與PERK解離，使其寡聚化并激活，進而磷酸化真核細胞起始因子2

4、α(eukaryoticinitiationfactor2α，eIF2α)，下調(diào)mRNA和蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯水平，減輕ER蛋白負荷。持續(xù)的激活PERK/eIF2α信號通路將上調(diào)CHOP的轉(zhuǎn)錄翻譯水平，最終引起細胞凋亡，是介導(dǎo)ER應(yīng)激整合調(diào)控反應(yīng)的重要細胞內(nèi)信號途徑之一。
　　 既往研究證實ER應(yīng)激與心血管疾病、神經(jīng)退行性變、糖尿病和缺血/再灌注損傷等多種疾病密切相關(guān)。研究證實心肌肥大時ER應(yīng)激標(biāo)志性分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(gluco

5、se-regulatedprotein78，GRP78)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)表達明顯上調(diào)，提示ER應(yīng)激參與了心肌肥大的過程。本課題組前期研究證實，ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG，抑制ER鈣泵繼而排空ER內(nèi)Ca2+)和衣霉素（tunicamycin，TM，抑制ER內(nèi)蛋白質(zhì)N-端糖基化）不僅可以誘導(dǎo)心肌細胞發(fā)生顯著的ER應(yīng)激，并直接誘導(dǎo)心肌細胞肥大。牛磺酸(Taurine，Tau)是體內(nèi)含

6、量最豐富的含硫自由氨基酸，具有穩(wěn)定細胞膜、調(diào)節(jié)細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)和清除氧自由基等多種生物學(xué)效應(yīng)。研究證實?；撬峥梢砸种艸cy等多種因素誘導(dǎo)的ER應(yīng)激，增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊能力并且減少修飾異常，對心肌細胞具有保護作用。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是一類可以引起劇烈縮血管效應(yīng)的活性多肽是目前最常用的誘導(dǎo)實驗性心肌細胞肥大的物質(zhì)之一，其致心肌細胞肥大的機制尚未完全闡明，我們認為PERK介導(dǎo)的ERS可能是AngⅡ致心肌細胞

7、肥大的機制。
　　 本工作在原代培養(yǎng)的乳大鼠心肌細胞AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞肥大模型上，研究ERS應(yīng)激分子GRP78、CRT以及PERK途徑相關(guān)分子表達的變化，進一步研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑?；撬釋τ贏ngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞肥大以及該過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。主要實驗方法和結(jié)果如下:
　　 1血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細胞肥大
　　 本部分實驗在原代乳鼠心肌細胞模型上，觀察AngⅡ和ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑對心肌細胞肥大的影響。采用不同濃度A

8、ngⅡ（10-7mmol/L、10-6mmol/L、10-5mmol/L）作用于心肌細胞48h;同時采用不同濃度TG（10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L）作用于心肌細胞48h;另外采用不同濃度TM（1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml）作用于心肌細胞72h。采用RT-PCR技術(shù)觀察心肌細胞肥大標(biāo)志性基因心房鈉尿肽（atrialnatriureticpeptide,ANP）和腦鈉肽(brainnatriure

9、ticpeptide，BNP)mRNA表達，[3H]-亮氨酸([3H]-Leucine)摻入技術(shù)測定心肌細胞蛋白質(zhì)合成速率，分析心肌細胞表面積變化，同時分析細胞凋亡率變化。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10-7mmol/LAngⅡ組、50nMTG組和10ng/mlTM組誘導(dǎo)ANP和BNPmRNA表達顯著上調(diào)，蛋白質(zhì)合成速率和細胞表面積明顯增加，并且心肌細胞凋亡率較低。上述結(jié)果提示AngⅡ和ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)原代乳鼠心肌細胞發(fā)生顯著肥大。

10、
　　 2血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細胞肥大過程中ERS相關(guān)分子表達變化
　　 CRT、GRP78是ER應(yīng)激的標(biāo)志性分子，而PERK/eIF2α信號途徑是ER應(yīng)激的重要信號通路之一。本部分實驗在原代乳鼠心肌細胞肥大模型上，通過檢測AngⅡ和ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑對心肌細胞ER應(yīng)激相關(guān)分子表達的影響，探討PERK介導(dǎo)的ERS在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大過程中的作用。采用10-7mmol/LAngⅡ作用于心肌細胞48h、50nMTG作用于

11、心肌細胞48h以及10ng/mlTM作用于心肌細胞72h。分別采用RT-PCR和qPCR技術(shù)檢測ER應(yīng)激相關(guān)分子CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOPmRNA表達，Westernblot技術(shù)檢測CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOP蛋白水平改變。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AngⅡ組、TG組和TM組CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOPmRNA和蛋白水平表達明顯增加，提示AngⅡ和ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)心肌

12、細胞發(fā)生明顯ER應(yīng)激，并且PERK/eIF2α信號途徑參與了心肌細胞的肥大過程。證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細胞肥大的重要機制之一。
　　 3?；撬嵬ㄟ^抑制ERS減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細胞肥大
　　 上述研究結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細胞肥大的重要機制之一，既往研究表明?；撬?Taurine，Tau)可以對心肌缺血、心力衰竭、心肌缺血再灌注損傷及心律失常起保護作用。本部分實驗在原代乳鼠肥大心肌細胞

13、肥大模型上，研究?；撬釋ngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞肥大過程中ERS分子的變化及其與心肌細胞肥大的關(guān)系。在AngⅡ、TG、TM誘導(dǎo)的肥大心肌細胞模型組中分別加入40mMTau作為?；撬岜Ｗo組。采用RT-PCR技術(shù)檢測ANP和BNPmRNA表達，[3H]-亮氨酸摻入技術(shù)測定心肌細胞蛋白質(zhì)合成速率，同時分析心肌細胞表面積變化。采用RT-PCR和qPCR技術(shù)檢測ER應(yīng)激相關(guān)分子CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOPmRNA表達，Weste

14、rnblot技術(shù)檢測CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOP蛋白水平改變。
　　 結(jié)果顯示，?；撬釡p輕AngⅡ、TG和TM引起的心肌細胞ANP和BNPmRNA表達上調(diào)、蛋白質(zhì)合成速率和細胞表面積的增加。?；撬徇€下調(diào)AngⅡ、TG和TM引起的心肌細胞ER應(yīng)激分子mRNA和蛋白水平表達。提示牛磺酸通過抑制ER應(yīng)激，減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細胞肥大。
　　 實驗結(jié)論如下:ER應(yīng)激是AngⅡ致心肌細胞肥大的機制之一。牛