PRRSV感染誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制研究.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是病毒蛋白折疊、裝配與成熟的場所，病毒感染細(xì)胞后常導(dǎo)致以未折疊蛋白大量積累為特征的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。發(fā)生應(yīng)激后，為了維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)和功能，細(xì)胞隨即啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，通過抑制病毒蛋白的合成、降解駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的病毒蛋白量或誘導(dǎo)促折疊伴侶分子表達(dá)等,應(yīng)對病毒感染導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。而病毒為了達(dá)到在細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制與感染的目的，則通過對UPR的精細(xì)調(diào)控消除對其增殖的不利因素，營造有利于其復(fù)制與增殖的微環(huán)境，同時(shí)病毒還通過調(diào)控UPR抑制

2、干擾素(IFN)等天然抗病毒分子的表達(dá)，從而逃避機(jī)體的免疫抑制作用，最終達(dá)到致病的目的。
　　 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起以妊娠母豬嚴(yán)重繁殖障礙以及仔豬呼吸道癥狀和高死亡率為特征的豬繁殖與呼吸綜合征，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，盡管在過去的20年間人們對PRRSV進(jìn)行了廣泛的研究，取得了一系列有重要意義的結(jié)果，但仍難以揭開這種“神秘病”的神秘面紗，尤其在病毒的感染機(jī)制和免疫機(jī)理等基礎(chǔ)研究方面，人們還知之甚少。

3、鑒于UPR在病毒的感染與免疫逃避中的重要作用，本研究主要針對PRRSV感染后誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行了深入探討，以期進(jìn)一步揭示PRRSV的感染與致病機(jī)理。主要研究內(nèi)容包括：
　　 1-PRRSV感染誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后的Marc-145細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生明顯的腫脹；同時(shí)利用SYBRReal-timeRT-PCR檢測PRRSV感染后不同時(shí)間內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的兩種標(biāo)志分子GRP78和GRP94的表達(dá)

4、情況，也發(fā)現(xiàn)PRRSV感染能顯著上調(diào)伴侶分子GRP78和GRP94的表達(dá)，并呈時(shí)間依賴性。說明PRRSV感染后能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。
　　 2.PRRSV感染激活PERK途徑通過Westernblotting檢測PERK的直接作用底物elF2a的磷酸化，發(fā)現(xiàn)在PRRSV感染后6h就能檢測到磷酸化的eIF2a,36h達(dá)到最高水平，48h有所下降，而總的eIF2a蛋白含量沒有明顯變化。說明PRRSV感染早期就能通過磷酸化的elF2a

5、抑制蛋白的翻譯，激活PERK途徑。對elF2a下游分子檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PRRSV持續(xù)感染，細(xì)胞不能通過UPR克服應(yīng)激時(shí)，磷酸化的elF2a通過激活轉(zhuǎn)錄因子ATF4誘導(dǎo)下游基因CHOP和GADD34的表達(dá)上調(diào)，由CHOP基因介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)由GADD34基因?qū)PR進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)。
　　 3.PRRSV感染激活I(lǐng)REl/XBP1途徑RT-PCR和酶切檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后，IRE1的唯一作用底物XB

6、P1表達(dá)上調(diào)，且多以XBPls剪切形式存在。利用SYBRReal-timeRT-PCR和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，XBPls的靶基因如介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解的蛋白EDEM和UPR負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白p58lPK以及僅依賴于XBPls識別的UPRE元件在PRRSV感染后的Marc-145細(xì)胞中均有上調(diào)。說明PRRSV感染激活I(lǐng)REl/XBP1途徑。
　　 4.PRRSV感染不激活A(yù)TF6途徑利用熒光素酶報(bào)告基因檢測PRRSV感染Marc

7、-145細(xì)胞后不同時(shí)間轉(zhuǎn)錄活化因子ATF6的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其未被激活。進(jìn)一步對其靶基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，能夠被ATF6識別的ERSE元件以及由ATF6誘導(dǎo)表達(dá)的一些重要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白PDI、ERp57、calnexin、calreticulin在PRRSV感染后的Marc-145細(xì)胞中均沒有顯著變化。說明PRRSV感染不激活A(yù)TF6途徑。
　　 5.PRRSVORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5編碼的蛋白參與UPR調(diào)控將

8、PRRSV各結(jié)構(gòu)蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒與熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒XBPl-Fluc共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，通過對XBPls的熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)PRRSVORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5編碼的蛋白可以誘導(dǎo)XBPls的表達(dá)，說明這幾個(gè)蛋白參與PRRSV誘導(dǎo)的UPR的調(diào)控。經(jīng)分析，這些蛋白都含有糖基化位點(diǎn)，而蛋白質(zhì)的糖基化抑制可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，因此我們推測，含有糖基化位點(diǎn)的蛋白更容易誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。
　　 6.PRRS

9、V感染通過CHOP誘發(fā)細(xì)胞凋亡CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑的關(guān)鍵細(xì)胞因子，在證實(shí)PRRSV感染能夠誘導(dǎo)CHOP基因的表達(dá)后，對其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后能上調(diào)凋亡標(biāo)志基因caspase3,9的表達(dá)，而當(dāng)CHOP的表達(dá)被siRNA抑制時(shí)，caspase3,9的表達(dá)也顯著下調(diào)，說明PRRSV感染能夠通過CHOP誘發(fā)細(xì)胞凋亡。對PRRSV在細(xì)胞中的增殖檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CHOP基因被抑制后，PRRSV的增殖顯著增強(qiáng)，說