內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與腦死亡狀態(tài)下肝損傷的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的
　　顱腦損傷（head injury）是臨床上導(dǎo)致腦死亡（brain death，BD）的主要原因之一。腦死亡是指包括腦干在內(nèi)的全腦功能喪失的不可逆轉(zhuǎn)的狀態(tài)。腦死亡概念是1959年由法國學(xué)者P. Mollaret和M. Goulon在第23屆國際神經(jīng)學(xué)會上首次提出并使用，用來描述這種嚴(yán)重大腦損傷后失去反射需要機(jī)械呼吸支持的不可逆昏迷的狀態(tài)。1966年美國學(xué)者提出腦死亡是臨床死亡的標(biāo)志。在1968年在第22屆世界醫(yī)學(xué)大會

2、上，美國哈佛醫(yī)學(xué)院腦死亡定義審查特別委員會提出“腦功能不可逆性喪失”作為新的死亡標(biāo)準(zhǔn)，并制定了世界上第一個(gè)腦死亡診斷標(biāo)準(zhǔn)，法律上承認(rèn)腦死亡等同于死亡。目前，世界大多數(shù)發(fā)達(dá)國家已認(rèn)可腦死亡，并相繼頒布腦死亡法，從法律上保障腦死亡臨床診斷。我國2003年中華醫(yī)學(xué)雜志等主要醫(yī)學(xué)雜志刊登了衛(wèi)生部腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)起草小組制訂的《腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)（成人）（征求意見稿）》和《腦死亡判定技術(shù)規(guī)范（成人）（征求意見稿）》。2009年4月，經(jīng)過修改與完善，其修

3、訂稿發(fā)表，比較詳細(xì)，具有可操作性。由于腦死亡是一個(gè)涉及醫(yī)學(xué)、倫理學(xué)、法學(xué)、社會學(xué)等多個(gè)學(xué)科的概念，盡管呼聲很高，我國實(shí)現(xiàn)腦死亡立法還有許多實(shí)際問題，但將是一種必然趨勢。
　　腦死亡供體是聯(lián)合國推薦優(yōu)先發(fā)展的器官移植供體，動物模型和臨床研究均已證明腦死亡是一個(gè)直接影響器官形態(tài)和功能的動態(tài)過程，其機(jī)制仍然不能完全明了。研究表明，腦死亡可引起心、腎細(xì)胞凋亡增加。進(jìn)而引起形態(tài)改變和功能受損。2003年發(fā)表于《Transplantation

4、》雜志上的關(guān)于腦死亡的文章，進(jìn)一步揭示腦死亡誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡增加，且以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞為主，其機(jī)制與死亡受體途徑和線粒體途徑均有關(guān)。另有多項(xiàng)研究證實(shí)，凋亡是造成腦死亡供體器官移植后生存力下降的原因之一。
　　最近的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERs）也是細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中的重要環(huán)節(jié)之一。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）在細(xì)胞內(nèi)分布廣泛，參與重要生理功能的

5、維持，主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的合成轉(zhuǎn)運(yùn)、信號肽識別、糖基化修飾等過程和鈣離子的貯存，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞內(nèi)鈣的再分布。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)巨大的膜結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)提供了一個(gè)寬廣的分子組裝、反應(yīng)平臺，使之在多種信號調(diào)控中起到關(guān)鍵作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能對大多細(xì)胞的活動和生存是必需的。
　　ERs途徑是獨(dú)立于細(xì)胞膜受體或線粒體途徑的第3條凋亡信號途徑。ER對諸如能干擾 ATP、氧化狀態(tài)及 Ca2+濃度等的內(nèi)環(huán)境改變非常敏感，這些改變會降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊能力，引起未折疊蛋白

6、的積累和聚集，從而激活未折疊蛋白反應(yīng)( unfolded protein response，UPR)，以保護(hù)由ERs所引起的細(xì)胞損傷，恢復(fù)細(xì)胞功能。但當(dāng)損傷超過修復(fù)能力時(shí)，ERs則引起細(xì)胞凋亡。以 ERs相關(guān)生物大分子作為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物研究將為相關(guān)疾病的預(yù)防和治療開辟新的途徑。許多肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制均與ERs引起的損傷有關(guān)，但ERs是否參與、介導(dǎo)腦死亡狀態(tài)下肝損傷、肝細(xì)胞凋亡的過程至今未見文獻(xiàn)報(bào)道。如能證實(shí) ERs參與了該過程的介導(dǎo)，并找

7、到針對 ERs途徑的干預(yù)措施來減輕肝損傷，將為腦死亡后器官功能保護(hù)提供新的思路，從而為臨床肝移植提供潛在的供體。
　　本課題擬分三個(gè)部分從組織及細(xì)胞水平揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與SD大鼠腦死亡狀態(tài)下肝損傷的分子機(jī)制。
　　第一部分：SD大鼠腦死亡模型的建立與維持
　　目的:
　　本研究擬在我們前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索采用緩慢間歇顱內(nèi)加壓法模擬顱內(nèi)出血、腦疝形成建立穩(wěn)定的Sprague Dawley（SD）大鼠腦死亡模型

8、以及較長時(shí)間維持腦死亡狀態(tài)的方法，為研究SD大鼠腦死亡狀態(tài)下的肝臟形態(tài)和功能變化及其他相關(guān)基礎(chǔ)、臨床研究提供穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)動物模型。
　　材料與方法:
　　實(shí)驗(yàn)動物：成年，雄性，健康，SD大鼠，體重250g～350g，自由飲食。
　　實(shí)驗(yàn)方法：顱骨鉆孔，硬腦膜外腔置入Fogarty3F氣囊導(dǎo)管，其尖端指向大鼠尾側(cè)，氣囊導(dǎo)管連接球囊壓力注射泵，通過向氣囊注入生理鹽水進(jìn)行顱內(nèi)加壓，直至達(dá)到腦死亡狀態(tài)。
　　腦死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)

9、：（1）深昏迷；（2）角膜反射消失；（3）瞳孔固定、散大；（4）靜息腦電圖；（5）自主呼吸消失。
　　觀察指標(biāo)：全程記錄生命體征（心率HR、呼吸R、體溫T、血壓BP）、尿量、血流動力學(xué)、腦電圖、脈搏氧飽和度（SPO2）及其與顱內(nèi)壓變化的相關(guān)規(guī)律。
　　實(shí)驗(yàn)分組：健康 SD大鼠隨機(jī)分為：①對照組（C組）：與腦死亡組對應(yīng)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=10只，腹腔注射麻醉后隱動脈置管（24G靜脈留置針，行有創(chuàng)動脈血壓監(jiān)測）、氣管插管、顱骨鉆孔并

10、置入Fogarty3F導(dǎo)管，并實(shí)時(shí)監(jiān)測動脈壓、脈搏氧飽和度、體溫、腦電圖變化，顱內(nèi)不加壓不建立腦死亡模型；②腦死亡組(BD組)，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為腦死亡0h、1h、2h、4h、6h時(shí)間點(diǎn)組，每時(shí)間點(diǎn)組10只，除以上操作外，應(yīng)用緩慢間歇顱內(nèi)加壓法建立腦死亡模型，通過呼吸、循環(huán)支持維持實(shí)驗(yàn)動物腦死亡狀態(tài)0h、1h、2h、4h、6h，維持腦死亡狀態(tài)要求大鼠生命體征穩(wěn)定：實(shí)時(shí)監(jiān)測平均動脈血壓(mean artery pressure，MAP)≥80

11、mmHg，體溫38.1±0.2℃，脈搏氧飽和度≥95％，呼吸機(jī)機(jī)械通氣支持，適當(dāng)增加吸入氣中氧含量，呼吸頻率、潮氣量由HARVARD動物呼吸機(jī)自動據(jù)體重計(jì)算參數(shù)，可適當(dāng)微調(diào)整，腦電圖呈靜息狀態(tài)，血流動力學(xué)穩(wěn)定。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠腦死亡模型的穩(wěn)定建立
　　采用緩慢間歇顱內(nèi)加壓法可模擬腦出血病理生理過程建立簡便、易重復(fù)的SD大鼠腦死亡模型，按實(shí)驗(yàn)要求穩(wěn)定保持腦死亡狀態(tài)6h，為后續(xù)相關(guān)研究提供可靠的動物模型。模型建立

12、過程詳見圖1-2，3，4，5，6，7，8。
　　2.平均動脈壓(MAP)的變化
　　腦死亡各組顯示相似的平均動脈壓變化過程，并與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。腦死亡判定后，在呼吸機(jī)支持的情況下，適當(dāng)調(diào)整吸入氣中氧濃度，腦死亡模型血流動力學(xué)穩(wěn)定，平均動脈壓維持在80mmHg以上，實(shí)驗(yàn)全程不使用血管活性藥物。與對照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。（圖1-14）
　　3.心率的變化
　　腦死亡過程心率出現(xiàn)典型的變化，每

13、個(gè)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)動物模型出現(xiàn)相同的變化過程，與對照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見圖1-13。
　　4.腦電圖的變化
　　隨著緩慢顱內(nèi)加壓誘導(dǎo)開始，腦電活動開始紊亂，腦電壓不穩(wěn)定，隨著顱內(nèi)壓的增高，腦電活動逐漸減弱，漸成一直線。腦死亡組各時(shí)間點(diǎn)組均出現(xiàn)相似的腦電變化過程，與對照組比較，差異顯著。詳見圖1-10，11，12。
　　第二部分：探討腦死亡狀態(tài)下SD大鼠肝臟形態(tài)與功能的變化
　　目的:

14、　　觀察腦死亡狀態(tài)下SD大鼠肝臟形態(tài)與功能的變化特點(diǎn)，研究腦死亡對肝臟的影響。
　　方法:
　　腦死亡組SD大鼠在腦死亡判定后0h、1h、2h、4h、6h分別停止呼吸支持，剖腹，于下腔靜脈處抽靜脈血，室溫靜止、離心后取血清分裝凍存管后-20℃或-80℃凍存待測；取相同部位肝組織分別：①迅速置入凍存管液氮保存；②切成小顆粒狀（0.5-1mm3）置入4%戊二醛液固定，4℃冷藏備電鏡切片；③肝組織切成片狀（約1-2cm2大小，厚度

15、為0.2-0.3cm）放入中性福爾馬林溶液浸泡制成石蠟塊。應(yīng)用全自動生化分析儀檢測血清肝臟酶學(xué)（ALT、AST）的變化；透射電鏡（TEM）觀察肝臟形態(tài)學(xué)變化；羅氏公司原位末端凋亡檢測試劑盒觀察肝組織凋亡細(xì)胞。對照組SD大鼠按上述時(shí)間點(diǎn)同樣方法取材。
　　結(jié)果:
　　1.腦死亡組大鼠0h、1h、2h、4h、6h不同時(shí)間點(diǎn)血清ALT、AST變化
　　腦死亡誘導(dǎo)判定后SD大鼠肝功能（ALT、AST）出現(xiàn)不同程度的變化，隨時(shí)間

16、的推移，ALT、AST呈逐漸升高趨勢，與對照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（附表2-1）。
　　2.電鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化
　　對照組 SD大鼠肝組織細(xì)胞未見明顯異常，腦死亡組 SD大鼠隨時(shí)間推移，肝組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷性變化，且逐漸加重，如輕度損傷為線粒體輕度腫脹，線粒體脊欠清晰，線粒體內(nèi)外膜破損（BD-2h），中度損傷表現(xiàn)為部分線粒體脊損傷（BD-4h），重度為線粒體脊融合，內(nèi)外膜破損，線粒體腫脹明顯，線粒體增生且膜性結(jié)

17、構(gòu)融合（附圖2-1）。
　　3.肝組織肝細(xì)胞凋亡檢測
　　對照組大鼠肝臟TUNEL染色少見凋亡。腦死亡組，SD大鼠肝臟細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加，且隨腦死亡維持時(shí)間的延長，肝細(xì)胞凋亡細(xì)胞逐漸增加（附圖2-2，3）。
　　第三部分：SD大鼠腦死亡過程是否啟動肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否介導(dǎo)或參與腦死亡狀態(tài)下肝損傷、肝細(xì)胞凋亡過程
　　目的:
　　探討SD大鼠腦死亡過程是否啟動肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否

18、介導(dǎo)或參與腦死亡狀態(tài)下肝損傷、肝細(xì)胞凋亡過程。
　　方法:
　　分別采用Western blot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR）、免疫組化（immunohistochemistry，IHC），對各實(shí)驗(yàn)組及不同時(shí)間點(diǎn)組肝組織標(biāo)本進(jìn)行 GRP78；XBP-1；CHOP；JNK；Caspase-12；ATF4基因及其部分蛋白表達(dá)分析

19、。
　　結(jié)果:
　　與對照組相比，腦死亡狀態(tài)下SD大鼠肝組織不同時(shí)間點(diǎn)隨時(shí)間推移內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)大分子物質(zhì)GRP78/BiP；XBP-1；CHOP/GADD153；JNK；Caspase-12；ATF4從基因水平均表達(dá)增加，其中 GRP78、CHOP、XBP-1、Caspase-12蛋白表達(dá)明顯增加，初步表明腦死亡過程誘導(dǎo) SD肝組織損傷，并啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、未折疊蛋白反應(yīng)，參與肝細(xì)胞損傷過程，差異具有顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（