腦死亡大鼠肝臟損傷機(jī)制中自噬現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　以緩慢持續(xù)顱內(nèi)加壓法構(gòu)建大鼠腦死亡模型，并在此基礎(chǔ)上動(dòng)態(tài)觀察大鼠肝組織細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，以初步明確腦死亡肝損傷機(jī)制中自噬發(fā)生的時(shí)序性，并探討細(xì)胞自噬死亡模式在肝損傷中的生物學(xué)意義。
　　方法：
　　選取SPF級(jí)SD大鼠80只，隨機(jī)分為8組各10只，隨機(jī)選取4組設(shè)為對(duì)照組（僅對(duì)各組大鼠進(jìn)行麻醉處理），并按麻醉時(shí)間分為0小時(shí)組、2小時(shí)組、4小時(shí)組、6小時(shí)組；其余4組設(shè)為腦死亡組，按照腦死亡標(biāo)準(zhǔn)判定腦死

2、亡后，將以上4組大鼠按照腦死亡狀態(tài)維持在0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)。通過(guò)SD大鼠顱骨鉆孔，將Fogarty3F球囊取栓導(dǎo)管置入SD大鼠硬腦膜外，導(dǎo)管尖端指向大鼠尾側(cè)，球囊導(dǎo)管連接微量泵并緩慢注入生理鹽水，進(jìn)行顱內(nèi)加壓，直至大鼠達(dá)到腦死亡狀態(tài)；分別采集對(duì)照組、腦死亡組SD大鼠靜脈血并檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate transaminase，AST），分析其變化

3、；獲取對(duì)照組、腦死亡組SD大鼠新鮮肝臟組織，進(jìn)行HE染色，觀察肝組織形態(tài)學(xué)的變化；并進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)染色方法動(dòng)態(tài)觀測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）表達(dá)情況，并進(jìn)行半定量測(cè)定，初步明確各時(shí)點(diǎn)組自噬與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化情況。
　　結(jié)果：
　　以緩慢持續(xù)顱內(nèi)加壓法建立SD大鼠腦死亡模型，在腦死亡組中0小時(shí)組、2小時(shí)組、4小時(shí)組、6小時(shí)大鼠A

4、LT指標(biāo)分別為：29.1±2.82、42.8±10.42、49.1±8.26、67.8±5.06；AST指標(biāo)分別為70.0±6.08、78.4±6.41、81.9±6.96、110.6±4.73，大鼠肝功能（ALT、AST）隨腦死亡狀態(tài)的時(shí)間增長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)；在大體觀發(fā)現(xiàn)，隨腦死亡時(shí)間增加，肝顏色偏暗紅色，無(wú)明顯壞死灶，質(zhì)地?zé)o顯著變化，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：0小時(shí)組顯示肝匯管區(qū)有少量炎癥細(xì)胞，肝血竇內(nèi)有少量庫(kù)否細(xì)胞，肝細(xì)胞核清晰，未見(jiàn)壞死，胞漿

5、染色一致，無(wú)水腫；2小時(shí)組顯示肝中央靜脈及肝血竇內(nèi)淤血，庫(kù)否細(xì)胞增生不明顯，近中央靜脈肝細(xì)胞淡染，核呈泡狀，胞漿內(nèi)有大小不等的空泡，肝血竇內(nèi)出現(xiàn)少量中性粒細(xì)胞；4小時(shí)組顯示肝中央靜脈及肝血竇內(nèi)淤血，庫(kù)否細(xì)胞增生，近中央靜脈肝細(xì)胞淡染，核呈泡狀，有較多雙核肝細(xì)胞，個(gè)別肝細(xì)胞壞死，胞漿內(nèi)有大小不等的空泡，肝血竇內(nèi)出現(xiàn)少量中性粒細(xì)胞；6小時(shí)組顯示肝中央靜脈及肝血竇內(nèi)淤血，庫(kù)否細(xì)胞增生明顯，部分肝細(xì)胞淡染，核呈泡狀，有較多雙核肝細(xì)胞，可見(jiàn)少量肝

6、細(xì)胞壞死但未形成灶性壞死，胞漿內(nèi)有大小不等的空泡，肝血竇內(nèi)出現(xiàn)較多中性粒細(xì)胞。此外，第4、6小時(shí)組中，肝組織出現(xiàn)巨噬細(xì)胞陽(yáng)性染色細(xì)胞。進(jìn)一步做自噬與凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，自噬蛋白在2小時(shí)時(shí)點(diǎn)出現(xiàn)明顯增高，一直持續(xù)到6小時(shí)時(shí)點(diǎn)，而凋亡抑制蛋白Bcl-2則在4小時(shí)時(shí)點(diǎn)開(kāi)始升高并持續(xù)高水平，相應(yīng)時(shí)點(diǎn)兩種蛋白表達(dá)水平均顯著高于0時(shí)點(diǎn)。
　　結(jié)論：
　?。?）以顱內(nèi)緩慢持續(xù)加壓法可建成SD大鼠腦死亡模型，可控性與成模率較高，并可導(dǎo)致肝