間歇低氧對肝臟損傷機制及自噬在肝臟中作用機制的探討.pdf

1、目的：阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）是常見的呼吸系統(tǒng)疾病，據(jù)統(tǒng)計有超過10％的人群罹患此病。OSA對于身體的嚴重危害及致死率增加，主要是因為OSA常合并糖尿病，代謝綜合征，心血管系統(tǒng)疾病等。目前很多證據(jù)顯示，由于OSA患者發(fā)生了氣體交換障礙（反復低血氧和高碳酸血癥）的病生理改變，即慢性間歇低氧（CIH），導致前炎癥因子產物增多，血管內皮功能紊亂，氧化應激，代謝調節(jié)異常和胰島素抵抗等。因為肝臟在人體是十分重要的代謝器官，肝細胞對各種內源性和

2、外源性刺激如病毒感染、炎癥、營養(yǎng)等非常敏感，現(xiàn)有很多報道OSA與肝臟的非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）有關。本研究旨在通過間歇低氧動物模型探討間歇低氧引起的肝臟損害，對肝臟藥物代謝酶細胞色素酶P450（CYPs）的影響及作用機制，從自噬角度對間歇低氧的作用做了進一步探討。實驗證實糖皮質激素受體（GR）對大鼠肝臟細胞色素酶P450（Cyps）的表達有重要的調控作用，并且對自噬有一定影響，所以又通過人的正常肝細胞LO2細胞初步探討糖皮質激素

3、在人肝臟細胞CYPs代謝的影響及自噬中的作用。
　　方法：
　　1.建立間歇低氧（IH）大鼠模型，將30只大鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分為2組（按照每組15只分組）：IH組和對照組。
　　2.大鼠肝臟組織進行固定、包埋、病理切片，然后進行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察肝組織形態(tài)學改變。
　　3.通過實時定量PCR方法測定炎癥因子、Cyps、NF-κB、核受體的相對基因表達量。
　　4.使用實時定量PCR法分析肝

4、臟自噬相關蛋白的基因表達。
　　5.將人正常肝細胞 LO2肝細胞進行常規(guī)培養(yǎng)，然后傳代，將傳代細胞按順序分別接種于6孔板，根據(jù)加入藥物不同，分為對照組，糖皮質激素（地塞米松， DEX）組和糖皮質激素+糖皮質激素受體拮抗劑（DEX+R）組；對照組：正常細胞培養(yǎng)；DEX組：加入地塞米松進行培養(yǎng)；DEX+R組：在DEX組基礎上加用糖皮質激素受體拮抗劑。
　　6.通過倒置顯微鏡觀察人肝細胞 LO2細胞形態(tài)的改變及生長情況變化并進行拍

5、照。
　　7.通過實時定量PCR方法測定肝細胞LO2細胞Cyps的相對基因表達量。
　　8.使用實時定量PCR法分析測定肝細胞LO2細胞自噬相關蛋白的基因表達。
　　結果：
　　1.對照組和間歇低氧組大鼠肝組織病理形態(tài)學改變：對照組：肝小葉結構完整，竇狀隙及匯管區(qū)未見明顯增寬及結構紊亂，肝細胞胞膜完整，胞質豐富，胞核形態(tài)正常，與正常肝組織無差異；間歇低氧組：肝小葉結構完整，竇狀隙呈輕度增寬，肝細胞結構完整，匯管區(qū)

6、可見少許炎細胞浸潤，以淋巴細胞為主，少許肝細胞胞質稀疏。
　　2.肝組織炎癥介質mRNA相對表達量的改變：IH組IL-1β、IL-6、TNFα mRNA相對表達量較對照組升高。
　　3.肝組織NF-κB mRNA相對表達量的改變：IH組NF-κB mRNA相對表達量較對照組顯著升高。
　　4.核受體mRNA相對表達量的改變：IH組PXR、GR、CAR mRNA相對表達量較對照組下調。
　　5.細胞色素氧化酶 P4

7、50（Cyps）mRNA相對表達量的改變：IH組 Cyp1A2、Cyp2D4、Cyp3A2 mRNA相對表達量較對照組下降有統(tǒng)計學差異；Cyp2C9、Cyp2C19 mRNA相對表達量與對照組相比無明顯差異。
　　6.細胞自噬相關基因（Atg）相對表達量的改變：IH組與對照組相比，AMPK， mTOR，Beclin1，Atg5，Atg12，Atg13，ULK1均有相應改變但無統(tǒng)計學意義， LC3與WIPI的變化有統(tǒng)計學意義。

8、>　　7.肝LO2細胞生長情況：地塞米松組LO2細胞生長變形，呈梭形生長，而加入糖皮質激素受體拮抗劑組，LO2細胞生長與對照組相同，為正常細胞形態(tài)。
　　8.肝LO2細胞Cyps表達：通過熒光實時定量PCR詳細闡述了各組人細胞色素酶P450（hCYP450）中hCYP1A2、hCYP2C9、hCYP2C19、hCYP2D6、hCYP3A4 mRNA在人肝臟LO2細胞中的相對表達量。與對照組相比，Dex組人肝臟LO2細胞的hCYP1

9、A2、hCYP2C19、hCYP3A4 mRNA表達量上調，相應的，Dex+R組人肝臟LO2細胞的上述基因表達下調，且有統(tǒng)計學差異；而Dex組人肝臟LO2細胞的hCYP2C9基因表達量較對照組為下降趨勢，hCYP2D6基因表達量較對照組無顯著變化
　　9.肝LO2細胞自噬相關基因的表達：通過熒光實時定量PCR詳細闡述了各組細胞的自噬相關基因的相對表達量。測定結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，除 Dex組人肝臟LO2細胞的Beclin1 mR

10、NA表達量下調外，余細胞自噬相關的基因及參與自噬過程的自噬相關蛋白的基因表達量較對照組均無顯著變化。
　　結論：
　　1.間歇低氧可以引起肝臟結構改變，促進炎性因子釋放，并通過 NF-κB-核受體通路來影響細胞色素酶Cyps的表達；
　　2.間歇低氧可以通過糖皮質激素受體通路誘導肝臟自噬，保護肝臟避免凋亡發(fā)生；
　　3.糖皮質激素可以影響肝細胞生長，并使細胞色素Cyps表達受影響；但是從實驗數(shù)據(jù)來看，對肝細胞自噬