Salubrinal減輕大鼠腦死亡狀態(tài)下肝損傷的分子機制研究.pdf

1、肝臟移植是治療終末期肝臟疾病最有效的治療途徑。制約肝臟移植發(fā)展的最主要因素是肝臟供體的短缺。腦死亡供體是肝臟移植的主要供體來源。腦死亡是指包括腦干功能在內的全腦功能不可逆和永久的喪失。腦死亡是一個復雜的病理生理過程，是一個直接影響器官形態(tài)和功能的動態(tài)過程。研究表明腦死亡來源的供體較活體來源的供體移植術后并發(fā)癥多、生存率低。因此，腦死亡被認為是造成供體器官損傷的一個獨立危險因素。細胞凋亡的增加是導致腦死亡供體肝臟損傷的主要因素。
　

2、　引起細胞凋亡的途徑有三條，內質網(wǎng)應激途徑引起凋亡是線粒體途徑和外源性途徑之外的第三條凋亡途徑。通常情況下，內質網(wǎng)通過未折疊蛋白反應保護由外界刺激對細胞的損傷，但是當應激時間延長或者應激強度增大，不能通過未折疊蛋白反應保護機制代償，最終會通過激活內質網(wǎng)應激凋亡通路引起細胞凋亡。
　　內質網(wǎng)類似激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，在內質網(wǎng)應激啟動后，通過

3、磷酸化真核生物的翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor2α,eIF2α）,介導細胞的凋亡。Salubrinal可通過選擇性誘導eIF2α磷酸化和抑制其去磷酸化來對抗內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress,ERs）誘導的細胞凋亡，并且其不保護與ERs無關的細胞凋亡刺激。研究表明Salubrinal能減輕細胞的凋亡。
　　因此，研究應用內質網(wǎng)應激

4、誘導凋亡抑制劑對腦死亡肝臟損傷的影響，有利于闡明腦死亡對肝臟損傷的機制，為腦死亡下器官功能的保護奠定理論基礎和提供藥物靶點。
　　目的：
　　探討內質網(wǎng)應激抑制劑Salubrinal對大鼠腦死亡狀態(tài)下肝損傷的影響及分子機制
　　方法：
　　第一部分：大鼠腦死亡模型制作方法的改進：在傳統(tǒng)漸進式誘導腦死亡模型的基礎上進行改良，采用緩慢間歇顱內加壓法，誘導腦死亡的發(fā)生。通過以下標準進行腦死亡的判定：深昏迷、腦干反射消失

5、、自主呼吸停止及腦電圖出現(xiàn)平直。在誘導腦死亡發(fā)生及維持腦死亡狀態(tài)時實時監(jiān)測顱內壓、腦電圖、心電圖、平均動脈壓、體溫等的變化。
　　第二部分：內質網(wǎng)應激介導腦死亡狀態(tài)下肝損傷的機制研究：在改良的大鼠腦死亡模型的基礎上，將大鼠隨機分為假手術組及腦死亡組。通過免疫組織化學及蛋白質免疫印跡檢測假手術組及腦死亡組大鼠肝臟中內質網(wǎng)應激分子標志物（Grp78和Xbp-1）及凋亡相關蛋白(Chop和Caspase-12)的變化。另外，利用原位細胞

6、凋亡法檢測肝細胞的凋亡及透射電鏡觀察肝細胞的微觀變化。通過熒光定量PCR檢測內質網(wǎng)應激凋亡相關基因的 mRNA表達變化。
　　第三部分：Salubrinal對大鼠腦死亡狀態(tài)下肝損傷的作用：將SD大鼠隨機分為3組：腦死亡組；腦死亡加DMSO組;腦死亡加Salubrinal組。腦死亡加DMSO組在誘導腦死亡前1小時腹腔注射DMSO;腦死亡加Salubrinal組在誘導腦死亡前1小時腹腔注射Salubrinal。qPCR檢測大鼠肝臟中C

7、hop及Caspase-12 mRNA的表達；Western blot檢測大鼠肝臟中PERK、p-eIF2α、eIF2α、Chop及 Caspase-12蛋白的表達；免疫組化檢測Chop及Caspase-12在大鼠肝組織中分布和表達；全自動生化分析儀檢測ALT及AST的表達；TUNEL法檢測肝細胞的凋亡。
　　結果：
　　第一：建立了穩(wěn)定的大鼠腦死亡模型：經(jīng)有效的呼吸循環(huán)支持均能成功誘導腦死亡的發(fā)生并且均能維持腦死亡狀態(tài)6小

8、時以上，平均動脈壓在80mmHg以上；
　　第二：內質網(wǎng)應激可能介導大鼠腦死亡狀態(tài)下的肝細胞損傷：腦死亡可以導致內質網(wǎng)應激的標志物Grp78和Xbp-1表達增加，以及內質網(wǎng)應激相關的凋亡蛋白Chop和Caspase-12表達增加。另外，通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)肝細胞出現(xiàn)細胞凋亡的特征以及通過原位細胞凋亡法檢測發(fā)現(xiàn)肝細胞凋亡增加；
　　第三：Salubrinal減輕大鼠腦死亡狀態(tài)下的肝損傷：腦死亡組及 DMSO加腦死亡組在Chop及C

9、aspase-12的mRNA及蛋白表達水平以及PERK、eIF2α及p-eIF2α的蛋白表達沒有統(tǒng)計學差異。Salubrinal干預后相對腦死亡組 p-eIF2α表達升高，eIF2α表達沒有明顯改變而P-PERK在腦死亡2h及6h表達降低。qPCR結果顯示：Salubrinal干預后Chop的mRNA表達在腦死亡4h明顯降低，Caspase-12的mRNA表達也明顯降低。我們也通過Western blot及免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)：Salu

10、brinal干預后Chop及Caspase-12的蛋白表達也明顯下降。此外，Salubrinal干預后，肝功得到改善，肝細胞的凋亡減輕。
　　結論：
　　經(jīng)改良的緩慢間歇顱內加壓法建立的大鼠腦死亡模型，較傳統(tǒng)的腦死亡模型相比具有維持腦死亡狀態(tài)時間長、簡單易復制、易于標準化、與臨床腦死亡相似的特點。
　　首次發(fā)現(xiàn)大鼠腦死亡狀態(tài)下啟動內質網(wǎng)應激，并且內質網(wǎng)應激的凋亡途徑介導腦死亡下的肝損傷。
　　首次發(fā)現(xiàn) Salub