淫羊藿素減輕急性肝損傷及其分子機制研究.pdf

1、[研究背景與目的] 淫羊藿素是近年來倍受關注的具有抗氧化、防治骨質(zhì)疏松、心血管疾病、保護神經(jīng)變性損傷、防治乳腺癌的單體藥物。用于分離淫羊藿素的箭葉淫羊藿，自古以來是一種重要的傳統(tǒng)中草藥。淫葉藿經(jīng)多重步驟的萃取與硅膠層析、洗脫后，可制得淫羊藿素。 淫羊藿素與其前體物質(zhì)淫羊藿苷具有極其相似的分子結構。其不同之處在于A環(huán)7位的糖苷鏈被羥基所代替(見圖1)。從藥物構效關系的角度推測其抗氧化功能將進一步增強。目前有關淫羊藿素的研究

2、證實：1、通過降低前列腺癌細胞線粒體的跨膜電勢，減少pRb、Cyclin D1及CDK4蛋白的磷酸化使前列腺癌細胞阻制于G1期從而產(chǎn)生抑制癌細胞增殖的作用；2、原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞的藥理研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿素可通過擬雌激素樣作用引起細胞增殖，減輕β樣淀粉酶對神經(jīng)細胞的損傷；3、誘導胚胎干細胞分化；4、可通過抑制酪氨酸蛋白激酶的表達、減輕細胞縫隙間連接蛋白的損傷減輕血管內(nèi)皮細胞的缺氧損傷；5、通過其抗氧化作用可促進成骨細胞的增殖，抑制破骨細胞，從

3、而防治骨質(zhì)疏松癥。 各種原因?qū)е碌母螕p傷是臨床工作中經(jīng)常遇到的問題，肝臟保護一直是研究的熱點問題。有關肝損傷保護藥物的研究、基因治療、外科干預措施等一直是較為活躍的領域之一，但仍缺乏高效的多靶點的保肝藥物。肝損傷的病理過程中，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)對細胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸的氧化作用是主要的損傷途徑。結合淫羊藿素已有的研究背景，我實驗室前期研究已經(jīng)證實淫羊藿素可以減輕脂肪肝小鼠的缺血再灌

4、注損傷。我們推測其可能存在減輕急性化學性肝損傷的藥理作用，有望成為治療肝損傷的治療藥物。本研究著重進行淫羊藿素瘁滅活性氧簇、擬雌激素樣作用調(diào)節(jié)肝細胞細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的體內(nèi)外實驗研究，初步評價淫羊藿素治療急性肝損傷的作用，探討其可能的分子機制。 [研究方法] 1淫羊藿素減輕CCL4誘導大鼠肝細胞損傷的體外實驗：建立大鼠肝細胞CCL4損傷模型，以淫羊藿苷為陽性對照藥物，在不同劑量淫羊藿素作用下，應用MTT法測定藥物作用前后

5、細胞存活率的變化、自動生化分析儀測定培養(yǎng)上清ALT、AST的含量、分光光度法測定細胞培養(yǎng)上清MDA、細胞內(nèi)SOD的變化，熒光顯微鏡觀察肝細胞ROS熒光強弱的變化，并對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。 2淫羊藿素減輕CCL4誘導大鼠肝細胞凋亡的體外實驗：建立大鼠肝細胞CCL4凋亡模型，以ICI182，780作為雌激素受體阻斷藥物，應用Western blot方法檢測不同濃度淫羊藿、不同作用時間后肝細胞PPARα和L-FABP蛋白以及BCL

6、-2/BAX凋亡相關蛋白表達的變化、細胞免疫化學染色檢測肝細胞L-FABP的表達水平、流式細胞儀及TUNNEL法檢測肝細胞的凋亡比率及形態(tài)學變化，并對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。 3淫羊藿素減輕CCL4誘導小鼠急性肝損傷的體內(nèi)實驗：利用去勢C57BL/6雌性小鼠建立CCL4急性肝損傷動物模型。以雌激素為陽性對照藥物、ICI182，780作為雌激素受體阻斷藥物，利用分光光度計測定血清ALT、AST的含量及肝組織MDA、SOD的變化、R

7、ealtime-PCR方法檢測肝組織內(nèi)PPARα和L-FABP轉(zhuǎn)錄水平的變化、HE組織切片染色評估肝組織損傷的差異、組織免疫化學染色測定肝組織L-FABP蛋白的表達水平、TUNNEL法檢測肝細胞的凋亡比例及形態(tài)學變化，并對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。 [實驗結果] 體外實驗 1淫羊藿素對CCL4損傷大鼠肝細胞存活率的影響：隨著淫羊藿素濃度的升高，CCL4損傷后的大鼠肝細胞存活率逐漸增加，且呈濃度依賴性。但濃度上升至1

8、0μmol/L時細胞活力不再升高，呈現(xiàn)下降趨勢。在同樣濃度下淫羊藿素提高肝細胞存活率的能力大約是淫羊藿苷的兩倍。 2淫羊藿素對CCL4損傷大鼠肝細胞后培養(yǎng)上清ALT、AST的影響：淫羊藿素可減少ALT、AST的釋放，在0.1uM-10uM范圍內(nèi)呈劑量依賴關系。淫羊藿素0.1uM，1uM，10uM組與模型組比較顯著降低(P＜0.05)，淫羊藿苷10uM組與模型組比較顯著降低(P＜0.01)。淫羊藿素10uM組與淫羊藿苷10uM組比

9、較降酶作用更強，前者約為后者的兩倍。 3淫羊藿素對CCL4損傷大鼠肝細胞后MDA、SOD及ROS的影響：淫羊藿素在0.1～100uM劑量范圍內(nèi)，可降低培養(yǎng)上清MDA的含量，并恢復肝細胞的SOD活性，且呈明顯的劑量依賴性。淫羊藿素減少活性氧簇的產(chǎn)生，相對于Icariin10uM組，Icaritin10uM組的ROS熒光度更低。 4淫羊藿素對CCL4損傷肝細胞后PPAR-α和L-FABP影響：不同濃度的淫羊藿素作用不同時間大

10、鼠肝細胞內(nèi)PPAR-α、L-FABP蛋白的表達逐漸增多，且呈藥物濃度與時間依賴性。Western-blot、細胞免疫組化方法均顯示正常對照組PPAR-α、L-FABP有一定水平的表達，CCL4損傷后表達下降，而1uM淫羊藿素組的表達則顯著增高，1uM Icaritin+ICI182，780組表達則顯著降低(P＜0.01)。 5淫羊藿素對CCL4損傷大鼠肝細胞凋亡相關蛋白及其細胞凋亡比率的影響：模型組、載體組的Bcl-2/Bax明

11、顯下降，而給予不同濃度淫羊藿素作用后，Bcl-2/Bax呈升高表現(xiàn)，其趨勢呈劑量依賴性。ICI182，780阻斷后，Bcl-2/Bax比值明顯下降(P＜0.05)。流式細胞儀及TUNNEL法檢測顯示1uM Icaritin處理后細胞凋亡率顯著低于模型組與DMSO載體對照組(P＜0.01)。1uM Icaritin組細胞凋亡率明顯低于1uMIcaritin+ICI182.780組(P＜0.05)。 體內(nèi)實驗 1淫羊藿素對急

12、性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響：1mg/Kg淫羊藿素組的ALT、AST低于模型組、載體組、Estrogen組(P＜0.05)，1mg/Kg Icaritin+ICI182，780組與1mg/Kg Icaritin組比較ALT、AST有顯著升高(P＜0.01)。 2淫羊藿素對急性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD的影響：1mg/Kg Icaritin組與Estrogen組比較，MDA、SOD顯著差異(P＜0.05)。Icarit

13、in+ICI182，780組與1mg/KgIcaritin組比較差異顯著(P＜0.05)。 3淫羊藿素對急性肝損傷小鼠肝組織PPARα、L-FABPmRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響：損傷模型組及載體組，PPAR-α未見明顯變化，而L-FABP呈一定程度的下降(與對照組比較P＜0.05)。在1mg/Kg Icaritin組二者轉(zhuǎn)錄水平均顯著增高(P＜0.01)。E2組的PPAR-α、L-FABP的轉(zhuǎn)錄水平亦較模型組及載體組明顯升高(P＜0.

14、01)，并且高于Icaritin組，但二者無顯著差異(P＞0.05)。在ICI182780組，PPAR-α、L-FABP的轉(zhuǎn)錄水平較Icaritin組、雌激素組明顯下降(P＜0.01)。L-FABP抗體免疫組織化學染色結果顯示，模型組及載體組的染色范圍及染色強度弱于較對照組。而1mg/Kg淫羊藿素組、雌激素組表達則明顯增強(P＜0.01)，1mg/Kg淫羊藿素+ICI182，780組則減弱(P＜0.01)。 4淫羊藿素對急性肝損

15、傷小鼠肝組織損傷程度的影響：模型組和載體組小鼠肝損傷組織學積分為3分，而1mg/Kg淫羊藿素組、雌激素組積分分別為0.8，1.2分，與模型組與載體組比較差異顯著(P＜0.01)，淫羊藿素+ICI182，780組的積分為1.4分，與1mg/Kg淫羊藿素組比較有顯著差異(P＜0.05)。 5淫羊藿素對急性肝損傷小鼠肝組織的凋亡指數(shù)變化：1mg/Kg淫羊藿素組肝細胞的凋亡比率明顯低于模型組與載體組(P＜0.01)。1m/Kg淫羊藿素+

16、ICI182，780組凋亡數(shù)量顯著增多，凋亡率明顯高于淫羊藿素與雌激素處理組(P＜0.05)。 [結論] 1淫羊藿素有較強的瘁滅活性氧簇的藥理作用，可以減輕肝細胞過氧化損傷。 2淫羊藿素可通過擬雌激素作用上調(diào)肝細胞內(nèi)L-FABP蛋白的表達，從而通過基因途徑提高肝細胞的抗氧化能力。 3淫羊藿素可通過上調(diào)Bcl-2/Bax比值減輕氧化損傷誘導的肝細胞凋亡。 4淫羊藿素是一種有效、多靶點的減輕急性肝損傷