腦死亡狀態(tài)下大鼠肝組織中基因表達(dá)變化及肝損傷防護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前，肝臟移植的供肝主要來自腦死亡患者的捐獻(xiàn)。然而，實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)：與活體供肝相比，腦死亡供肝移植術(shù)后的缺血再灌注損傷重、急性排斥反應(yīng)發(fā)生率高，出現(xiàn)初始肝功能不良和原發(fā)性移植物無功能的風(fēng)險(xiǎn)大。因此，國內(nèi)外學(xué)者建立了大量動物腦死亡模型來研究腦死亡狀態(tài)對潛在供體器官的影響以及可能的干預(yù)措施。
　　腦死亡是指“包括腦干在內(nèi)的全腦功能不可逆性的喪失”，可以引起機(jī)體復(fù)雜的病理生理變化，主要表現(xiàn)為血流動力紊亂、激素水平改變、炎癥和免疫系統(tǒng)

2、被激活、補(bǔ)體和凝血系統(tǒng)被激活。這些不利因素導(dǎo)致線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞凋亡通路被激活，使細(xì)胞凋亡增加，嚴(yán)重影響了腦死亡供肝的質(zhì)量。但是，腦死亡狀態(tài)下肝損傷的具體分子機(jī)制仍不清楚。因此，研究腦死亡狀態(tài)下肝臟組織中基因的變化，可以為減輕腦死亡狀態(tài)下肝損傷提供潛在的干預(yù)靶基因。
　　血紅素加氧酶1（heme oxygenase1，HO-1）又稱為熱休克蛋白32（heat shock protein，HSP32），是降解血紅素的限速酶，具有

3、抗炎和抗凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)，腦死亡狀態(tài)下腎臟中HO-1和HSP70高表達(dá)。鈷原卟啉（cobalt protoporphyrin，CoPP）預(yù)處理腦死亡供體誘導(dǎo) HO-1高表達(dá)，減輕移植腎中炎性細(xì)胞浸潤，并可以將腦死亡供腎移植后3個(gè)月的移植物存活率從20％顯著提高至50%。腦死亡狀態(tài)是否促進(jìn)肝臟中熱休克蛋白的表達(dá)，HO-1誘導(dǎo)劑-CoPP是否能減輕腦死亡狀態(tài)下肝臟損傷，其分子作用機(jī)制是什么至今還不清楚。
　　本課題擬從以下三個(gè)部分

4、進(jìn)行研究，建立大鼠腦死亡模型，分析腦死亡狀態(tài)下大鼠肝組織中基因表達(dá)情況，探討CoPP對腦死亡狀態(tài)下大鼠肝損傷的分子作用機(jī)制，以期為提高腦死亡供肝質(zhì)量提供新的思路和方法，從而為臨床肝移植提供更多可用的腦死亡供體。
　　第一部分：緩慢間斷顱內(nèi)加壓法建立大鼠腦死亡模型
　　目的：為研究腦死亡狀態(tài)對肝臟質(zhì)量的影響，建立一種穩(wěn)定、可靠的大鼠腦死亡模型。方法：采用SD大鼠，顱骨鉆孔在硬膜外腔放置3F Fogarty球囊導(dǎo)管，通過間斷緩慢

5、加壓法誘導(dǎo)大鼠腦死亡。以自主呼吸停止、腦電波靜息、腦干反射消失和深昏迷作為腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)。尾靜脈補(bǔ)羥乙基淀粉溶液維持腦死亡6h期間平均動脈壓大于80mmHg。腦死亡組20只大鼠；假手術(shù)對照組（n=10）不行球囊加壓，其余操作同腦死亡組。監(jiān)測大鼠的動脈血壓、心率、呼氣末CO2、補(bǔ)液量和尿量，檢測血清ALT和AST水平，觀察肝組織病理變化。結(jié)果：大鼠腦死亡模型的成功率為90%，加壓誘導(dǎo)前準(zhǔn)備時(shí)間為70±10min，腦死亡加壓誘導(dǎo)時(shí)間為34±

6、6min，加壓球囊所需的液體量為136±24μl。腦死亡組大鼠的羥乙基淀粉輸入量為36.46±17.85ml，尿量為32.77±18.44ml，血清中ALT和AST分別為70.17±15.87U/L、201±23.31U/L，均明顯高于假手術(shù)對照（均P＜0.05）。光學(xué)顯微鏡下觀察可見，假手術(shù)對照組大鼠的肝臟組織形態(tài)正常；腦死亡組的大鼠肝臟呈現(xiàn)明顯的淤血和水腫，肝索增寬，肝竇變窄，存在散在的點(diǎn)狀壞死。
　　第二部分：腦死亡狀態(tài)下大

7、鼠肝組織中基因表達(dá)變化
　　目的：分析腦死亡狀態(tài)下大鼠肝組織中基因表達(dá)變化，為揭示腦死亡狀態(tài)下肝損傷的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：分別在大鼠腦死亡后0h、1h、2h、4h、6h留取標(biāo)本，假手術(shù)對照組大鼠也在相對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)留取標(biāo)本，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠。用Agilent大鼠全基因組表達(dá)譜芯片分析腦死亡6h及假手術(shù)對照的大鼠肝臟組織中41012個(gè)基因的表達(dá)情況。qPCR檢測大鼠腦死亡后0h、1h、2h、4h、6h肝臟中HO-1、HSP2

8、7、HSP70、Mcl-1、Bcl-2、BNIP3、Caspase-3、HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α、ARNT和Glut-1的表達(dá)情況。Western blotting和免疫組化檢測大鼠腦死亡后肝臟中 HO-1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與假手術(shù)對照組比，腦死亡6h大鼠肝臟組織中有149個(gè)基因表達(dá)上調(diào)超過10倍，有136個(gè)基因表達(dá)下調(diào)超過10倍。腦死亡后0h、1h、2h、4h、6h的大鼠肝臟中HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)

9、，HO-1蛋白表達(dá)在胞漿，在肝小葉中央靜脈周圍的肝臟細(xì)胞高表達(dá)。BNIP3和Caspase-3的mRNA表達(dá)水平在腦死亡后0h、2h、4h、6h大鼠肝臟中明顯上調(diào)。
　　第三部分：CoPP減輕大鼠腦死亡狀態(tài)下肝損傷的分子作用機(jī)制
　　目的：探討HO-1誘導(dǎo)劑-CoPP對大鼠腦死亡狀態(tài)下肝損傷的作用及其分子機(jī)制。方法：將大鼠隨機(jī)分成4組，每組6只。腦死亡(B)組：大鼠腦死亡維持6h；假手術(shù)(S)組：不加壓球囊誘導(dǎo)腦死亡，其余操

10、作同腦死亡組；CoPP預(yù)處理腦死亡(CB)組：術(shù)前24h腹腔注射CoPP5mg/kg，其余操作同腦死亡組；CoPP預(yù)處理假手術(shù)(CS)組：術(shù)前24h腹腔注射CoPP5mg/kg，其余操作同假手術(shù)組。全自動標(biāo)準(zhǔn)生化分析儀檢測血清中ALT和AST的水平。Western blotting檢測肝臟中 Bcl-2、Bax、Mcl-1、CHOP、Caspase-12、cytosolic Cytochrome c和cleaved-Caspase-3蛋

11、白的表達(dá)。TUNEL檢測大鼠肝臟中細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：CoPP預(yù)處理顯著誘導(dǎo)大鼠肝臟中HO-1蛋白高表達(dá)。與腦死亡組比，CoPP預(yù)處理腦死亡組大鼠的血清ALT和AST水平明顯降低，肝臟中Bcl-2和Mcl-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而 Bax、CHOP、Caspase-12、cytosolic Cytochrome c和cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，肝臟中凋亡細(xì)胞明顯減少。
　　結(jié)論：
　　1.建立了穩(wěn)定、可

12、靠、重復(fù)性好的大鼠腦死亡模型，為進(jìn)一步研究腦死亡狀態(tài)對供體器官的影響提供了基礎(chǔ)。
　　2.首次全面分析了腦死亡狀態(tài)下大鼠肝臟組織中基因的表達(dá)，為減輕腦死亡狀態(tài)下肝臟損傷提供了新的干預(yù)靶基因；腦死亡后肝臟組織中HO-1表達(dá)上調(diào)，可能與腦死亡相關(guān)應(yīng)激啟動的保護(hù)性機(jī)制有關(guān)。
　　3.HO-1誘導(dǎo)劑-CoPP可以顯著上調(diào)HO-1蛋白表達(dá)，并通過調(diào)控線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑中關(guān)鍵蛋白，減輕腦死亡大鼠肝臟中細(xì)胞凋亡。HO-1有望成為提高腦