肝寧方對肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下UPR跨膜蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是是廣泛存在于真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，其能夠保持蛋白質(zhì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，多種外界因素可干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及未折疊蛋白反應(yīng)。未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)最初是作為細(xì)胞的一種適應(yīng)性反應(yīng)，但是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激長期存在的情況下，也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激幾乎涉及了所有的慢性肝病。衣霉素(TM)是一種常用的體外內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)試劑，在一定的濃度和作用時(shí)間下，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，而肝寧方則可能是通過干擾內(nèi)

2、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的信號UPR通路起到保護(hù)肝細(xì)胞的作用。
　　目的:基于醫(yī)學(xué)生物學(xué)層面上，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，肝寧方干預(yù)后，IRE1，PERK，ATF6這三個(gè)跨膜蛋白的蛋白表達(dá)是否存在差異，來闡明肝寧方是否對肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)存在影響，以期為臨床治療慢性肝病提供新的思路與方法。
　　方法:
　　(1)準(zhǔn)備好肝寧方藥物，以之予SD大鼠灌胃后取大鼠腹主動(dòng)脈血，分離血清后滅菌保存?zhèn)溆谩?br>　　(2)在激光共聚焦顯微鏡下觀察GRP

3、78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及胞漿中的分布情況。(3)體外培養(yǎng)正常人肝細(xì)胞，并把細(xì)胞分為對照組、模型組和治療組，每組各1瓶。模型組為衣霉素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，治療組則是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型成功的基礎(chǔ)上予肝寧方含藥血清干預(yù)72小時(shí)。提取蛋白后蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western-blot)檢測GRP78，IRE1，ATF6，PERK，eIF2α的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　(1)共聚焦顯微鏡下激光共聚焦顯微鏡下觀察到的GRP78密度模型組比正常組

4、明顯增多，說明造模成功。
　　(2)分子伴侶GRP78及跨膜IRE1，ATF6，PERK蛋白表達(dá)水平在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的情況下明顯升高，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而在肝寧方含藥血清干預(yù)后，其表達(dá)水平有所下降，與對照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與模型組對比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3) eIF2α磷酸化水平在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的情況下明顯升高，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05