布魯氏菌VceC蛋白對(duì)山羊滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和性腺激素分泌的影響.pdf

1、布魯氏菌（Brucella）是革蘭陰性兼性胞內(nèi)寄生菌，能夠引起布魯氏菌病(Brucellosis)，簡(jiǎn)稱布病。布病是一種在家畜和人類間廣泛傳播的人畜共患傳染病，給很多國(guó)家和地方造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和公共安全問(wèn)題。該病屬于慢性疾病，可能持續(xù)數(shù)周或數(shù)月，如果不能被有效治療，就會(huì)引起肝臟，脾臟，淋巴結(jié)，骨髓，生殖系統(tǒng)以及骨骼系統(tǒng)出現(xiàn)病理變化。胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞是布魯氏菌主要的靶細(xì)胞之一，已有的研究結(jié)果表明布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)生存主要與宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)

2、網(wǎng)(ER)緊密相關(guān)。而布魯氏Ⅳ型分泌系統(tǒng)對(duì)布魯氏菌抑制宿主天然免疫應(yīng)答和胞內(nèi)生存具有重要作用，主要是通過(guò)分泌效應(yīng)分子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。VceC蛋白是布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的效應(yīng)分子和主要毒力因子之一，揭示其在感染宿主細(xì)胞中的作用及其作用機(jī)制，對(duì)于闡明布魯氏菌胞內(nèi)生存和免疫逃逸的機(jī)制具有重要意義。本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建VceC的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染山羊滋養(yǎng)層細(xì)胞(GTC)，檢測(cè)(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性分子GRP78和CHOP蛋白表達(dá)量變化，未折疊蛋白反應(yīng)(UP

3、R)信號(hào)通路的激活，以及UPR通路中IRE1蛋白表達(dá)變化，分析VceC蛋白對(duì)布魯氏菌感染過(guò)程中宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響;(2)山羊滋養(yǎng)層細(xì)胞上清液中分泌的孕酮和雌激素的濃度變化，探究VceC蛋白在布魯氏菌侵染GTC過(guò)程中對(duì)其性腺激素分泌的影響。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.克隆布魯氏菌VceC基因，利用pEGFP-C1載體構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-C1-VceC，轉(zhuǎn)染GTC，利用免疫熒光和Western Blot檢測(cè)VceC蛋白，

4、結(jié)果表明，成功構(gòu)建及轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pEGFP-C1-VceC。
　　2.以pEGFP-C1-VceC轉(zhuǎn)染GTC，通過(guò)Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GRP78表達(dá)在12 h和24 h均顯著升高(P＜0.01)，而24 h后CHOP表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，表明VceC蛋白能夠激發(fā)GTC的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng);RT-PCR和Western Blot進(jìn)一步檢測(cè)UPR相關(guān)分子，結(jié)果表明，VceC蛋白激活UPR中的IRE1通路引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)