突變型Myocilin調(diào)控人小梁細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1997年StoneEM等于《science》雜志上首次報(bào)道Myocilin基因?yàn)樵l(fā)性開角型青光眼的致病基因，自此掀起開角型青光眼發(fā)病機(jī)制的新的研究熱潮。然而，到目前為止，Myocilin基因突變是否是家族性開角型青光眼的確切致病基因仍眾說紛紜，存有爭議。 1985年，葛堅(jiān)教授在我國首次確立家族性開角型青光眼大家系—廣州1號(hào)(GZ.1)。此后，其所帶領(lǐng)的課題組對該家系進(jìn)行了長達(dá)20年的追蹤調(diào)查，并展開一系列全面、系統(tǒng)的臨床及實(shí)

2、驗(yàn)室研究，確定Myocilin基因P370L突變是GZ.1家族性開角型青光眼的致病基因，該家系患者中P370L突變頻率為100％；進(jìn)而，GZ.1家系密切相關(guān)的P370L突變型Myocilin蛋白功能的初步研究顯示P370L突變型Myocilin蛋白細(xì)胞外分泌障礙，在胞漿內(nèi)形成積聚體(aggresomes)引起人小梁細(xì)胞收縮、粘附、遷移功能的改變。然而，P370L突變型Myocilin究竟通過何種病理途徑損傷人小梁細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而導(dǎo)致

3、GZ.1家族性開角型青光眼的發(fā)病尚不清楚。 本研究為闡明P370L突變型Myocilin的人小梁細(xì)胞損害機(jī)制，通過構(gòu)建P370L突變型Myocilin基因真核表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人小梁細(xì)胞，建立P370L突變型Myocilin體外功能研究模型，經(jīng)系統(tǒng)分子生物學(xué)方法檢測發(fā)現(xiàn)P370L突變型Myocilin調(diào)控人小梁細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，擾亂其蛋白質(zhì)合成及分泌功能，同時(shí)損傷線粒體結(jié)構(gòu)及功能，導(dǎo)致人小梁細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞粘附性下降，細(xì)胞死

4、亡。另外，我們還發(fā)現(xiàn)P370L突變型Myocilin上調(diào)人小梁細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通路—糖蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解反應(yīng)，在早期損傷同時(shí)激發(fā)細(xì)胞保護(hù)性反應(yīng)。 據(jù)此，我們證實(shí)P370L突變型Myocilin蛋白因蛋白錯(cuò)誤折疊，構(gòu)象改變而獲得病理性功能，通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體功能引發(fā)人小梁細(xì)胞級(jí)聯(lián)病理反應(yīng)。本研究初步揭示P370L突變型Myocilin的人小梁細(xì)胞損傷機(jī)制，為其完全釋解提供確實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為GZ.1家族性開角型青光眼發(fā)病

5、機(jī)制的研究以及有效防治措施的發(fā)展提供新思路。 目的：通過在體外人小梁細(xì)胞中特定表達(dá)P370L突變型Myocilin蛋白，檢測其因錯(cuò)誤折疊，構(gòu)象改變對人小梁細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體功能的調(diào)控作用，探討P370L突變型Myocilin對小梁細(xì)胞的損傷機(jī)制，為釋解P370L突變型Myocilin的致病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為GZ.1開角型青光眼家系發(fā)病機(jī)制的研究以及有效防治措施的發(fā)展提供新思路。 方法 1.應(yīng)用定點(diǎn)誘變技術(shù)構(gòu)

6、建P370L突變型MYOC真核表達(dá)載體，通過陽離子脂質(zhì)體將pcDNA3.1載體，pcDNA-wild-type-MYOC載體及pcDNA-MYOC-P370L載體體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人小梁細(xì)胞； 2.應(yīng)用RT-PCR檢測人小梁細(xì)胞Myocilin、GRP78、ATF4、ATF6及XBP1mRNA的表達(dá)； 3.應(yīng)用Westernblot檢測人小梁細(xì)胞Myocilin蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78蛋白、XBP1蛋白、Phospho-

7、eIF2alpha蛋白的表達(dá)； 4.應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)染色法通過共聚焦顯微鏡觀察GRP78蛋白與Myocilin蛋白的共定位情況以及Paxillin的表達(dá)； 5.應(yīng)用MTT法檢測人小梁細(xì)胞代謝率； 6.應(yīng)用JC-1染色法通過流式細(xì)胞儀及共聚焦顯微鏡檢測人小梁細(xì)胞線粒體膜電位； 7.應(yīng)用AnnexinV/PI染色法通過流式細(xì)胞儀檢測人小梁細(xì)胞磷脂酰絲氨酸外翻； 8.應(yīng)用倒置相差顯微鏡和透射電鏡進(jìn)行人小

8、梁細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的觀察。 結(jié)果 1.酶切及測序鑒定確定pcDNA-MYOC-P370L真核表達(dá)載體閱讀框及突變位點(diǎn)正確。 2.RT-PCR及Westernblot檢測結(jié)果顯示pcDNA-wild-type-MYOC載體及pcDNA-MYOC-P370L載體轉(zhuǎn)染后人小梁細(xì)胞MyocilinmRNA及Myocilin蛋白表達(dá)顯著增加。 3.RT-PCR及Westernblot檢測結(jié)果分別顯示pcDNA-M

9、YOC-P370L載體轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組相比人小梁細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78mRNA、GRP78蛋白質(zhì)及Phospho-eIF2α蛋白表達(dá)顯著減少，XBP1mRNA及XBP1蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增多；而pcDNA-wild-type-MYOC載體轉(zhuǎn)染組無明顯變化。 4.pcDNA-MYOC-P370L載體轉(zhuǎn)染組人小梁細(xì)胞MTT代謝率為(72.6±3.8)％明顯低于pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組(92.5±4.2)％，

10、兩組相比MTT代謝率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而pcDNA-wild-type-MYOC載體轉(zhuǎn)染組無明顯改變。 5.pcDNA-MYOC-P370L載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人小梁細(xì)胞熒光探針JC-1的紅色/綠色熒光強(qiáng)度比值(1.4±0.3)顯著低于pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組(3.2±0.4)(P＜0.01)；而pcDNA-wild-type-MYOC載體轉(zhuǎn)染組無明顯變化。共聚焦顯微鏡觀察顯示各組均無細(xì)胞色素C的釋放。 6

11、.共聚焦顯微鏡觀察顯示pcDNA-MYOC-P370L載體轉(zhuǎn)染組人小梁細(xì)胞Paxillin蛋白質(zhì)的表達(dá)量與pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比明顯減少；而pcDNA-wild-type-MYOC載體轉(zhuǎn)染組其表達(dá)無明顯改變。 7.AnnexinV/PI雙標(biāo)法結(jié)果顯示pcDNA-MYOC-P370L瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，人小梁細(xì)胞FITC-AnnexinV(+)/PI(-)細(xì)胞占總細(xì)胞的百分率為(47.09±4.16)％，與pcDNA3.1空載

12、體轉(zhuǎn)染組相比明顯增高(12.38±1.18)％(P＜0.01)；而pcDNA-wild-type-MYOC載體轉(zhuǎn)染組無明顯變化。 8.相差顯微鏡下pcDNA-MYOC-P370L載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組人小梁細(xì)胞形態(tài)異常，空泡變，并有大量細(xì)胞死去。透射電鏡觀察到人小梁細(xì)胞細(xì)胞膜不完整、線粒體嵴斷裂、線粒體腫脹、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張以及脂滴和空泡增多；而pcDNA-wild-type-MYOC載體轉(zhuǎn)染組人小梁細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)無明顯改變。

13、 結(jié)論 1.P370L突變型Myocilin蛋白因錯(cuò)誤折疊、構(gòu)象改變而獲得病理性調(diào)控功能，擾亂人小梁細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，改變其合成和分泌功能。 2.P370L突變型Myocilin蛋白在損傷人小梁細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的同時(shí)引發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)和氧化磷酸化功能的損傷，嚴(yán)重影響細(xì)胞生物活性，表明P370L是一種強(qiáng)致病性突變位點(diǎn)。 3.P370L突變型Myocilin真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人小梁細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，引發(fā)相應(yīng)