鉛誘導的中樞神經系統(tǒng)星形膠質細胞內質網(wǎng)應激反應.pdf

1、目的： 重金屬鉛是一種普遍存在的環(huán)境神經毒物，低水平的慢性鉛暴露對嬰幼兒中樞神經系統(tǒng)不可逆的損害以及對學習記憶能力的影響是一個備受關注的重大問題。嬰幼兒的消化道對鉛的吸收率較成人約高5倍，而排泄率較成人低，加之兒童血腦屏障發(fā)育不全，因此鉛極易在嬰幼兒神經系統(tǒng)發(fā)生蓄積。0～6歲兒童的大腦智力發(fā)育對鉛的敏感性高于成人30倍，我國很多城市兒童鉛中毒已達到36-40％，是美國兒童的10余倍。研究表明當兒童的血鉛由0.48μM升高到0.9

2、7μM時，智商平均下降2～6分。 神經膠質細胞占人類腦細胞的90％，是神經系統(tǒng)的支持細胞，在構成髓鞘、促進神經細胞發(fā)育、神經組織修復和再生等方面有重要作用，其中的一大類細胞星形膠質細胞對神經元的發(fā)育、遷移、突觸的形成、遞質傳遞的調節(jié)、能量供應以及維持中樞神經系統(tǒng)內環(huán)境穩(wěn)定，都起著十分重要的作用。目前研究認為星形膠質細胞(astrocyte)較內皮細胞對鉛更為敏感，認為鉛可能是通過損害星形膠質細胞，進而損害內皮細胞，從而增加血-腦

3、屏障通透性而進入腦，最終損害腦功能的。 研究發(fā)現(xiàn)，缺氧、低糖、重金屬等應激信號可以使內質網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)內錯誤折疊蛋白增多，可誘發(fā)未折疊蛋白反應(unfolded proteinreaction，UPR)，通過上調分子伴侶如葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated proteins，GRP78)等幫助蛋白正確折疊以減輕細胞損傷。當應激強度過大，ER功能嚴重受損時細胞將啟動生長抑制

4、DNA損傷誘導因子(growth arrest and DNA damageinducible gene，GADD153)等信號觸發(fā)細胞凋亡。 有實驗證實，暴露于較高濃度鉛環(huán)境的幼鼠腦中的鉛大部分被隔離在星形膠質細胞中，并可以檢測出一種分子量為23KD的新蛋白可以結合鉛，另外，也有學者提出，星形膠質細胞可能通過內質網(wǎng)應激蓄積大量的鉛，從而保護更為敏感的神經元。這些證據(jù)表明，在非生理性金屬的刺激下，機體很可能啟動了一種耐受機制，即

5、染鉛后星形膠質細胞通過某些蛋白的高表達與鉛螯合，作為鉛蓄積庫以保護中樞神經系統(tǒng)的正常功能。 本研究用醋酸鉛作用于原代培養(yǎng)的腦星形膠質細胞，觀察其對細胞增殖、細胞周期和CyclinD1、GADD153及GRP78表達量的影響。為了探討GRP78是細胞內質網(wǎng)上鉛作用的靶蛋白，本研究還觀察了細胞內鉛離子與GRP78的螯合作用，以及鉛誘導GRP78表達的一些信號轉導通路，以證明GRP78是細胞內質網(wǎng)上的一種鉛結合蛋白。 方法：

6、 1、Wistar大鼠腦星形膠質細胞的原代培養(yǎng)，分別加入醋酸鉛、PD98059(ERK上游激酶MEK1的特異性抑制劑)及Wortmannin(PKB上游激酶PI3K的特異性抑制劑)培養(yǎng)不同時間，加入醋酸鈉作為對照。 2、免疫組化法觀察細胞GFAP表達以鑒定原代培養(yǎng)星形膠質細胞的純度。 3、MTT比色法觀察醋酸鉛對星形膠質細胞增殖的影響。 4、流式細胞技術分析醋酸鉛對星形膠質細胞的細胞周期進程的影響。

7、 5、Western blot法檢測醋酸鉛誘導CyclinD1和GADD153蛋白表達變化。 6、免疫沉淀方法純化出醋酸鉛誘導的GRP78蛋白，Western blot方法檢測純化的GRP78蛋白量變化，石墨爐原子吸收法檢測純化產物中的鉛含量。 7、膠體金免疫電鏡法觀察醋酸鉛誘導的GRP78定位的改變。 8、Western blot和RT-PCR方法檢測鉛誘導的ERK和PKB活性的變化，以及其誘導GRP78表達的

8、信號轉導通路。 結果： 1、免疫組化法結果顯示：原代培養(yǎng)腦星形膠質細胞經過差速粘附處理后，傳代2～4代后，細胞狀態(tài)穩(wěn)定。經顯微鏡下細胞計數(shù)觀察，95％以上的細胞胞漿著黃褐色，胞核著藍色，證明絕大多數(shù)培養(yǎng)的原代細胞為星形膠質細胞。 2、MTT比色法結果顯示：醋酸鉛可抑制星形膠質細胞增殖，且與鉛的水平呈劑量依賴關系，1.0μM醋酸鉛濃度作用細胞8天起，細胞增殖比下降具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 3、流式細

9、胞技術結果顯示：與醋酸鈉對照相比，經1.0μM醋酸鉛處理8、12、15、30 d后，星形膠質細胞的細胞周期停滯在G1期(58.64±1.75％→69.81±1.56％，70.80±1.27％，90.59±1.25％，80.9±1.11％)。 4、Western blot結果顯示： (1)醋酸鉛使星形膠質細胞CyclinD1蛋白表達呈時效依賴性下降趨勢(P<0.05)。 (2)1.0μM醋酸鉛作用于細胞30天以后，

10、星形膠質細胞GADD153蛋白開始表達。 (3)醋酸鉛能誘導星形膠質細胞內質網(wǎng)GRP78蛋白表達增加，此誘導作用具有量效依賴性和時效依賴性。0.2、1.0、10μM的醋酸鉛作用于細胞24小時，都可誘導GRP78表達的增加，1.0和10μM醋酸鉛效果顯著(P<0.01)。1.0 μM的醋酸鉛作用于細胞24小時后，GRP78表達量顯著增高，4～8天左右達到峰值(P<0.01)，約12天左右表達量開始下降，至染鉛30天時仍高于對照組(

11、P<0.05)。P13K抑制劑wortmannin和MEK1抑制劑PD98059均能抑制醋酸鉛誘導的GRP78蛋白表達的增加(P<0.05)，wortmannin的抑制效果更明顯。 (4)醋酸鉛能誘導星形膠質細胞ERK蛋白活性增高，具有時效依賴性和量效依賴性。0.2、1.0、10μM的醋酸鉛作用于細胞30分鐘，都可誘導ERK活性增高，以1.0μM的醋酸鉛效果最明顯(P<0.05)。1.0μM的醋酸鉛作用于細胞5分鐘時ERK活性開

12、始增高，30分鐘時達到峰值，隨后又逐漸降至正常水平。MEK1抑制劑PD98059能抑制醋酸鉛誘導的ERK活性增高(P<0.05)。 (5)醋酸鉛能誘導星形膠質細胞PKB蛋白活性增高，具有時效依賴性和量效依賴性。0.2、1.0、10μM的醋酸鉛作用于細胞30分鐘，都可誘導PKB活性增高，以1.0μM的醋酸鉛效果最明顯(P<0.05)。1.0μM的醋酸鉛作用于細胞5分鐘時PKB活性開始增高，30分鐘時達到峰值，隨后又逐漸降至正常水平

13、。PI3K抑制劑wortmannin能抑制醋酸鉛誘導的PKB活性增高(P<0.05)。 5、免疫沉淀及石墨爐原子吸收法結果顯示：GRP78能緊密螯合進入細胞內的鉛離子。1.0μM醋酸鉛處理細胞后，用親和層析法將細胞裂解液中的GRP78蛋白純化，western blot方法檢測純化產物為分子量78KD的單一蛋白質。純化后的產物用石墨爐原子吸收儀檢測鉛含量，1.0μM醋酸鉛作用于細胞24小時后純化產物中的鉛含量開始顯著增高，8天左右

14、達到峰值(P<0.01)，隨后鉛含量下降，但仍高于對照組(P<0.05)。 6、膠體金免疫電鏡結果顯示：1.0μM醋酸鉛作用于細胞24小時后，星形膠質細胞內GRP78的表達量開始顯著增加，并且其定位由內質網(wǎng)轉移至胞核周圍胞漿。10μM醋酸鉛作用于細胞10小時后，細胞也有類似變化。 7、RT-PCR分析結果顯示： (1) 醋酸鉛能誘導星形膠質細胞內質網(wǎng)的GRP78 mRNA表達增加，具有時效依賴性和量效依賴性；PI

15、3K抑制劑wortmannin和MEK1抑制劑PD98059都可抑制醋酸鉛的作用(P<0.05)，wortmannin的抑制效果更為明顯。 (2)醋酸鉛能誘導星形膠質細胞的ERK2 mRNA表達增加(P<0.05)。MEK1抑制劑PD98059可抑制此作用。 結論： 1、在原代培養(yǎng)的鼠腦星形膠質細胞中，醋酸鉛可誘導未折疊蛋白反應，使細胞CyelinD1蛋白水平下降，細胞周期停滯在G1期；長時間鉛暴露甚至可誘導GA

16、DD153蛋白表達，但并未觀察到細胞的凋亡。 2、醋酸鉛誘導星形膠質細胞內質網(wǎng)GRP78 mRNA水平和蛋白水平表達增加，PI3K抑制劑wortmannin和MEK1抑制劑PD98059都可阻斷此誘導作用。醋酸鉛可依賴MEK1/ERK、PI3K/PKB通路促進GRP78表達。 3、細胞內的GRP78可以與鉛離子緊密螯合，此作用具有量效依賴性。 4、醋酸鉛經MEK途徑迅速激活星形膠質細胞ERK活性，經P13K途徑迅