布魯氏菌Omp25對胚胎滋養(yǎng)層細胞炎性機制初步研究.pdf

1、目的：布魯氏菌?。╞rucellosis）(以下簡稱布病)是由布魯氏菌引起的人、畜共患傳染病，廣泛分布于世界各地。布病對我國經(jīng)濟建設、人民健康生活、國家安全等存在著嚴重的威脅。布病的病原為布魯氏菌，是一種胞內(nèi)寄生菌,它的致病機制以胞內(nèi)生存為主要特征。胚胎滋養(yǎng)層細胞是布魯氏菌感染的靶細胞，一旦被破壞，容易引起流產(chǎn)，但是其分子機制目前還不清楚。布魯氏菌外膜蛋白和Ⅳ型分泌系統(tǒng)家族蛋白與布魯氏菌的侵染、胞內(nèi)生存、繁殖有直接關(guān)系，是公認的毒力因子

2、。通過探討毒力因子對感染靶細胞的作用成為研究布魯氏菌致病機制的分子基礎，為探索布病藥物作用的候選靶點奠定理論基礎。
　　 方法：（1）以pET32a為載體，構(gòu)建了原核表達載體pET32a-omp25，經(jīng)IPTG誘導在大腸桿菌中得到了表達43.5 KD Omp25融合蛋白，并成功分離純化蛋白。（2）以真核表達質(zhì)粒pEGFP為載體，將omp25基因克隆至EGFP基因上游，構(gòu)建表達Omp25-EGFP融合蛋白的真核表達載體pEGFP-

3、omp25；（3）根據(jù)omp25核苷酸序列，分別構(gòu)建siRNA -a/b/c三個干擾載體，應用脂質(zhì)體，將pEGFP-omp25分別與siRNAs共轉(zhuǎn)染HPT-8細胞，實時定量PCR篩選最優(yōu)干擾質(zhì)粒。（4）以 Omp25蛋白的毒力效應及其作用機制為切入點，分別以正相（已純化Omp25蛋白刺激）和反向（RNAi）分析方法，對Omp25蛋白誘發(fā)人胚胎滋養(yǎng)層細胞HPT-8引發(fā)的炎性信號分子表達進行了檢測。
　　 結(jié)果：（1）成功構(gòu)建高效

4、表達載體pET32a-omp25，并分離純化蛋白；（2）成功構(gòu)建表達pEGFP-omp25真核質(zhì)粒和構(gòu)建針對omp25三個干擾載體，實時定量篩選出了優(yōu)秀干擾片段，抑制率可達到98%；（3）ELISA檢測結(jié)果顯示：NO,LDH活力及上清中炎性相關(guān)細胞因子TNF-α隨Omp25蛋白濃度呈不同程度的上升；（4）實時定量PCR檢測結(jié)果顯示Omp25蛋白使得TLR4和MyD88 mRNA表達量上調(diào)。
　　 結(jié)論：（1）低劑量的Omp25