BPDE誘導(dǎo)Swan 71滋養(yǎng)層細胞線粒體損傷的機制.pdf

1、目的：
　　苯并[α]芘（Benzo(a)pyrene，B(a)P）是已知的致畸、致癌、致突變及內(nèi)分泌干擾物，大量的研究顯示，B(a)P可以引起子癇、子宮內(nèi)生長受限、流產(chǎn)等滋養(yǎng)層相關(guān)疾病，然而潛在機制尚不明確。本研究擬通過B(a)P在體內(nèi)的代謝終致突變物7,8-二羥基-9,10-環(huán)氧苯并[α]芘（BPDE）對滋養(yǎng)層細胞系Swan71進行染毒，觀察其細胞和線粒體功能的改變及其具體分子機制。探索線粒體損傷在滋養(yǎng)層細胞功能紊亂中的作用，

2、為滋養(yǎng)層相關(guān)疾病的治療提供新的思路。
　　方法：
　　1.MTT法檢測BPDE對Swan71細胞活力的影響，根據(jù)結(jié)果確立染毒濃度和時間。采用Transwell的方法檢測各組細胞的侵襲能力；采用ELISA和Western blot的方法測定各組細胞HCG分泌能力；流式細胞儀檢測細胞凋亡；酶標儀檢測細胞內(nèi)ROS、MDA和SOD的含量；RT-qPCR檢測促炎因子（TNF-а、IL-6） mRNA的改變；熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位的

3、改變；透射電鏡觀察線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變；實時熒光定量PCR檢測線粒體DNA拷貝數(shù)的改變。
　　2.采用RT-qPCR、Western blot技術(shù)檢測線粒體各組分裂融合基因和蛋白（Mfn1、Mfn2、OPA1、Drp1和Fis1）的表達情況。采用Western blot的方法對凋亡相關(guān)蛋白（P53、Bcl-2、Bak和Bax）、線粒體和胞漿中的Cytc以及Caspase3前體和活化產(chǎn)物進行檢測。
　　結(jié)果：
　　1.

4、BPDE對Swan71細胞功能的影響
　　與對照組相比，0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.8μmol/L組Swan71細胞的侵襲能力逐漸減弱，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；與對照組相比，0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組Swan71細胞上清中HCG的含量和細胞絨毛膜促性腺激素β蛋白的表達量逐漸降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；BPDE可以促進Swan71細胞凋亡，

5、且0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）
　　2.BPDE對Swan71細胞氧化損傷的影響
　　與對照組相比，0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組細胞內(nèi)ROS和MDA的水平逐漸增加，SOD的水平逐漸下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組相比，1μmol/L和2μmol/L組促炎因子TNF-а和IL-6 mRNA表

6、達逐步上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。
　　3.BPDE對Swan71細胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響
　　隨著BPDE濃度的增加，線粒體膜電位逐漸降低；透射電鏡觀察，0.5μmol/L組線粒體線粒體腫脹扭曲，線粒體嵴紊亂，膜片段化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。1μmol/L組線粒體顯示出更嚴重的空泡化、破裂和溶解，線粒體嵴溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈泡狀結(jié)構(gòu)。線粒體DNA拷貝數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，0.25μmol/L、0.5μmol/L和1

7、μmol/L組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.BPDE對Swan71細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響
　　隨著BPDE濃度的增加，P53、Bak1和Bax的蛋白表達量逐漸增加，Bcl-2的蛋白表達量逐漸降低。且除 P530.25μmol/L組外各染毒組與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5.BPDE對Swan71細胞分裂融合基因的影響
　　與對照組相比，0.5μmol/L、1μ

8、mol/L和2μmol/L組線粒體融合基因OPA1、Mfn1和 Mfn2表達逐漸下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組線粒體分裂基因Fis1表達逐漸上調(diào)，1μmol/L和2μmol/L組Drp1表達逐漸上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組相比，0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L組線粒體融合蛋白OPA1表達逐漸下降，各染毒組中Mfn1和Mfn2表達逐

9、漸下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各染毒組中Drp1和Fis1表達逐漸上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。
　　6.BPDE對Swan71細胞Cyt c釋放和Caspase3的影響
　　隨著BPDE濃度的增加，胞漿中的Cyt c蛋白的含量逐漸增加，而線粒體中的Cyt c蛋白的含量逐漸下降，Caspase3前體逐漸減少，而活化的Caspase3逐漸增多，且除0.25μmol/L組外差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜