GABA信號(hào)對(duì)人滋養(yǎng)層細(xì)胞分化的調(diào)控及機(jī)制研究.pdf

1、背景：胎盤(pán)在人類(lèi)妊娠過(guò)程中扮演著十分重要的角色，胎盤(pán)的發(fā)育是否良好直接關(guān)系著妊娠的成敗，而在胎盤(pán)的早期形成和后期發(fā)育過(guò)程中，滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化起著決定性的作用。囊胚發(fā)生植入時(shí)，滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞首先與母體子宮內(nèi)膜接觸，形成最初的錨定絨毛，其內(nèi)的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞（cytotrophoblast,CTB）不斷發(fā)生融合形成新的多核的合胞體滋養(yǎng)層（syncytiatrophoblast,STB）。CTB通過(guò)不斷增殖、融合而維持STB的生長(zhǎng)，直到受精后1

2、4天時(shí)，單核的CTB突破STB并侵入子宮基質(zhì)成為滋養(yǎng)層細(xì)胞柱，這些具有侵襲性的滋養(yǎng)層細(xì)胞稱(chēng)為絨毛外滋養(yǎng)層（extravillous trophoblast,EVT），其可侵入母體子宮間質(zhì)及螺旋動(dòng)脈，通過(guò)血管的改建使胎盤(pán)血流量增加以滿(mǎn)足胎兒快速生長(zhǎng)發(fā)育的需求；而位于游離絨毛外層的STB則直接與母體血液接觸，完成對(duì)營(yíng)養(yǎng)和氣體的交換。胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化受到多種因素如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和激素等的調(diào)控，其異?？蓪?dǎo)致多種妊娠疾病的產(chǎn)生，如自發(fā)流產(chǎn)

3、、胎兒生長(zhǎng)受限、子癇前期和絨毛膜癌等。
　　GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過(guò)離子通道型受體（GABARA和 GABARC）和代謝型受體（GABARB）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮功能。GABARA是由5個(gè)亞基構(gòu)成的五聚體，迄今已發(fā)現(xiàn)α1-6,β1-4,γ1-4,δ1-3,ε,π和θ，其中π亞基（GABRP）廣泛分布于子宮、前列腺、胸腺和肺等外周組織或器官，在子宮中，可參與對(duì)胚胎容受性的調(diào)節(jié)以及妊娠期間子宮肌肉靜息狀態(tài)的維

4、持。GABARB是一種 G蛋白耦聯(lián)受體，由 B1亞基和 B2亞基組成的二聚體， GABARB1(GB1)的多種剪切體在中樞神經(jīng)及外周組織中廣泛表達(dá)，在子宮中，可能參與平滑肌收縮性的調(diào)節(jié)，而B(niǎo)2亞基的剪切體只表達(dá)于中樞神經(jīng)組織。此外，GABRP和 GABARB還參與多種腫瘤組織生長(zhǎng)和侵襲的調(diào)節(jié)。
　　基于胚胎植入與腫瘤侵襲的相似性和GABA信號(hào)在生殖系統(tǒng)中的特異表達(dá)，推測(cè)GABA信號(hào)可能參與調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜的侵襲行為。課題組

5、前期研究發(fā)現(xiàn)GABA信號(hào)在妊娠小鼠蛻膜及發(fā)育胎盤(pán)中呈時(shí)空特異性表達(dá)，且通過(guò)GABARA與GABARB參與母體子宮的蛻膜化反應(yīng)和胎盤(pán)的形成，但在人類(lèi)妊娠早期胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞分化中的作用及機(jī)制尚不明確。
　　目的：研究GABA信號(hào)在人滋養(yǎng)層細(xì)胞分化過(guò)程中的功能及分子機(jī)理。
　　方法：1.定量 PCR技術(shù)檢測(cè) GABRP在不同滋養(yǎng)層細(xì)胞系（HTR8/SVneo、JEG-3、JAR、BeWo）的差異表達(dá)；免疫組化技術(shù)檢測(cè) GABR

6、P在人不同妊娠時(shí)期胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中的表達(dá)。2.利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建包含GABRP全長(zhǎng)基因的pIRES2-EGFP質(zhì)粒，半定量PCR及Western blotting檢測(cè)GABRP的過(guò)表達(dá)效果；定量PCR篩選具有干擾效率的GABRP siRNA片段。3. Matrigel細(xì)胞侵襲模型、流式細(xì)胞術(shù)及 CCK8分別檢測(cè)過(guò)表達(dá) GABRP對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/Svneo侵襲、凋亡及活力的影響，并用定量PCR及Western blotti

7、ng檢測(cè)凋亡調(diào)控因子的表達(dá)。免疫組化及定量PCR技術(shù)檢測(cè)GABRP在正常胎盤(pán)絨毛及子癇前期胎盤(pán)絨毛中的表達(dá)差異。4.定量 PCR、Western blotting及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) GABRP對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞合體化的影響。5.免疫組化技術(shù)檢測(cè) GABA及 GB1在人不同妊娠時(shí)期胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中的表達(dá)，分別用GABA及GB1受體激動(dòng)劑/抑制劑處理滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/Svneo，利用Matrigel細(xì)胞侵襲模型檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞侵襲的影響。

8、>　　結(jié)果：1.GABRP在四種不同滋養(yǎng)層細(xì)胞系呈差異表達(dá)，在 JEG-3中表達(dá)量最高，其次為 HTR8/SVneo、BeWo，在 JAR中表達(dá)最低。GABRP表達(dá)于妊娠期間的胎盤(pán)絨毛中，在妊娠早期主要分布于 STB中，而在妊娠中后期，CTB的表達(dá)逐漸增高。2.成功構(gòu)建含 GABRP全長(zhǎng)片段的 pIRES2-EGFP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染 HTR8/SVneo細(xì)胞后，GABRP的mRNA和蛋白均能過(guò)表達(dá)；篩選出的GABRP siRNA干擾片段，成功

9、下調(diào) BeWo中GABRP的表達(dá)。3.在HTR8/SVneo中過(guò)表達(dá)GABRP72h后，用Matrigel細(xì)胞侵襲模型、流式細(xì)胞術(shù)及CCK8檢測(cè)分別發(fā)現(xiàn)，侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少（P<0.05），細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞活力明顯降低（P<0.05）；GABRP在 HTR8/SVneo中的過(guò)表達(dá)使促凋亡因子Bad、Bax，效應(yīng)caspase3及其活性形式的表達(dá)增加，而抑凋亡因子Bcl-2的表達(dá)也有增加（P<0.05）；免疫組化與定量 PCR結(jié)果

10、發(fā)現(xiàn)， GABRP在子癇前期胎盤(pán)絨毛組織中的表達(dá)高于同時(shí)期的正常胎盤(pán)絨毛組織（P<0.05）。4.過(guò)表達(dá)GABRP使HTR8/SVneo細(xì)胞中的合體化標(biāo)記物β-hCG、syncytin-2表達(dá)增加，敲低合體化細(xì)胞模型 BeWo中GABRP的表達(dá)，其合體化標(biāo)記物β-HCG、syncytin-2的表達(dá)降低。Forskolin誘導(dǎo)BeWo合體化的同時(shí)，伴隨GABRP表達(dá)上調(diào)（P<0.05），相反，敲低GABRP的表達(dá)，F(xiàn)orskolin對(duì)Be

11、Wo合體化的誘導(dǎo)受到抑制。5. GABA及GB1表達(dá)于妊娠期間的胎盤(pán)絨毛中，在妊娠早期主要分布于 STB中，而在妊娠中后期，CTB的表達(dá)逐漸增高。GABA及GB1受體激動(dòng)劑處理 HTR8/SVneo細(xì)胞48 h后，侵襲細(xì)胞數(shù)目增加（P<0.05），而其抑制劑則使侵襲細(xì)胞數(shù)目減少（P<0.05）。
　　結(jié)論：GABRP在正常滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8/SVneo中的過(guò)表達(dá)使細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞侵襲減少，且GABRP在子癇前期胎盤(pán)

12、絨毛中的表達(dá)高于正常胎盤(pán)絨毛，提示GABRP可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡而減少侵襲，這或許也與子癇前期的病理機(jī)制有關(guān)。GABRP在妊娠早期胎盤(pán)絨毛STB中強(qiáng)表達(dá)，且在滋養(yǎng)層細(xì)胞模型中，隨合體化進(jìn)程，其表達(dá)升高；而干預(yù) GABRP的表達(dá)，細(xì)胞合體化標(biāo)記物表達(dá)降低，證實(shí)GABRP參與調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的合體化。GABA及GB1受體激動(dòng)劑處理HTR8/SVneo細(xì)胞后，侵襲細(xì)胞數(shù)目增加，GB1受體抑制劑則使侵襲細(xì)胞數(shù)目減少，提示GABA也可能通過(guò)GB1受