Wnt-β-catenin信號通路對不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)早孕絨毛滋養(yǎng)層細胞調(diào)控及機制研究.pdf

1、本文從以下幾個方面展開論述：
　　第一部分 β-caten in及DDK1在URSA患者的絨毛滋養(yǎng)層細胞和蛻膜組織中表達
　　目的：
　　原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)在臨床上一直是比較難治療的不育疾病，占復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的60％-70％。研究發(fā)現(xiàn)許多信號途徑對早期成功妊娠很重要，其中Wnt信號通路是一條高度保守的信號通路，在細胞的增殖、分

2、化、轉(zhuǎn)移、極性、粘附及干細胞的更新等過程起重要的調(diào)節(jié)作用。Wnt/β-catenin信號通路的適度激活可促進絨毛滋養(yǎng)細胞的侵襲和子宮內(nèi)膜蛻膜化，為胚胎的成功著床提供條件，但目前其具體的調(diào)控機制仍未充分闡明。盡管有研究表明DDK1在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病人中表達上調(diào)，然而Wnt/β-catenin的異常表達與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系尚未充分闡明。本課題第一部分擬通過研究β-catenin及DKK1(Dickkopf-l)在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)絨毛及

3、蛻膜組織中的表達情況，探討Wnt/β-catenin信號途徑在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的調(diào)控作用。
　　方法：
　　取不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常妊娠早孕絨毛及蛻膜組織各20例，本研究中選擇的所有不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者連續(xù)發(fā)生自然流產(chǎn)的次數(shù)均超過2次，患者年齡在26-36歲。正常流產(chǎn)患者為同期非意愿早期妊娠，主動要求終止妊娠患者。用免疫組化及Western blot分別檢測不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常孕婦妊娠早孕期絨毛及蛻膜組織中β-caten

4、in的定位及蛋白水平的表達，用實時熒光定量PCR分別檢測蛻膜及絨毛組織中β-catenin和DDK1 mRNA的水平。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化顯示β-catenin主要分布在絨毛滋養(yǎng)層細胞膜上，部分分布在細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)，蛻膜組織中主要分布在腺體細胞的細胞膜上。不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者β-catenin表達水平低于正常流產(chǎn)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。
　　2.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的絨毛和蛻膜組織中，West

5、ern結(jié)果顯示β-catenin蛋白表達顯著低于正常流產(chǎn)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，且絨毛及蛻膜組織中β-catenin低表達的患者分別占全部20名患者的70％(P＜0.001)及50％(P=0.0145)。
　　3.URSA患者絨毛和蛻膜組織中，β-catenin mRNA的相對表達水平顯著低于正常流產(chǎn)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，而DKK1 mRNA水平顯著高于正常流產(chǎn)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.

6、001)。
　　結(jié)論：
　　正常妊娠及不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)絨毛及蛻膜組織中均可檢測到β-catenin及DKK1 mRNA，表明Wnt信號途徑在正常妊娠中起重要作用。β-catinin在正常早孕及不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者早孕絨毛的細胞滋養(yǎng)細胞膜和細胞核表達，表明Wnt信號途徑參與了細胞滋養(yǎng)細胞的增殖過程。此外，在蛻膜組織的腺上皮表達也檢測到β-catinin的表達，Wnt信號途徑可能參與蛻膜組織的腺體在早孕期絨毛滋養(yǎng)細胞入侵、胎

7、盤形成及胎兒的生長過程。不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的絨毛和蛻膜組織的β-catinin表達顯著下調(diào)，而DKK1表達顯著上調(diào)，表明Wnt信號通路在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者是受抑制的，wnt/β-catinin表達下調(diào)可能是導(dǎo)致滋養(yǎng)細胞增殖及侵襲受抑制，從而導(dǎo)致早期流產(chǎn)。Wnt信號通路的異常表達可能參與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的過程。
　　第二部分 Wnt信號分子對滋養(yǎng)層細胞增殖遷移的機制研究
　　背景：
　　作為Wnt信號通路最上游

8、的因子，Wnt配體對信號通路的激活起到一個開關(guān)的作用。妊娠的不同時期絨毛滋養(yǎng)層細胞和子宮內(nèi)膜（蛻膜）在增生期和分泌期基質(zhì)和腺體細胞表達的Wnt配體也有所不同。10種Wnt配體及8種卷曲受體的在早孕胎盤組織中都有表達，但不同滋養(yǎng)細胞類型Wnt配體的表達有所不同，且隨孕周的增加其表達也會發(fā)生改變。WNT1，WNT7b，WNT10a和WNT10b，從早孕期到晚孕期表達逐漸下降;WNT1在細胞滋養(yǎng)細胞和絨毛外滋養(yǎng)細胞均大量表達，WNT2、WNT

9、3在細胞滋養(yǎng)細胞和絨毛外滋養(yǎng)細胞均中量表達，而WNT7b、WNT9b在細胞滋養(yǎng)細胞大量表達，但在絨毛外滋養(yǎng)細胞表達顯著下調(diào)。表明WNT1、WNT2、WNT3對細胞滋養(yǎng)細胞的增生，絨毛外滋養(yǎng)細胞的分化和侵襲過程中起重要的作用。WNT2、WNT4、WNT5a、WNT7a、LRP6和β-catenin在子宮內(nèi)膜的增生期和分泌期表達相當。wnt3在子宮內(nèi)膜增生期表達顯著高于分泌期。β-catenin在增生期和分泌期內(nèi)膜的腺體和基質(zhì)細胞均大量表達

10、。此外，研究發(fā)現(xiàn)WNT2，WNT4，WNT5a，WNT7a，WNT8b，和WNT3，可通過月經(jīng)周期的變化而調(diào)節(jié)，通過旁分泌的形式影響絨毛滋養(yǎng)細胞的功能。這些結(jié)果都表明Wnt/β-catenin及DKK1的表達在絨毛外滋養(yǎng)細胞的侵襲、遷移及胚胎植入過程中起重要作用。
　　目的：
　　前期研究不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者Wnt信號通路是受抑制的。但是究竟哪些關(guān)鍵性的Wnt配體異常表達會影響不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛滋養(yǎng)層細胞的增殖能力

11、和侵襲能力降低，目前還不是很清楚;本項目擬在前期工作的基礎(chǔ)上，采用各種細胞生物學(xué)及分子生物學(xué)方法對不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛滋養(yǎng)層細胞差異Wnt配體進行篩選，揭示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路對人絨毛滋養(yǎng)細胞增生、遷移作用的分子學(xué)機制，從新的角度探索不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病機制，為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療篩選出高效的靶基因。
　　方法：
　　取不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常妊娠早孕絨毛及蛻膜組織各20例，本研究中選擇的

12、　　所有URSA患者連續(xù)發(fā)生自然流產(chǎn)的次數(shù)均超過2次，患者年齡在26-36歲。正常流產(chǎn)患者為同期非意愿早期妊娠，主動要求終止妊娠患者。用實時熒光定量PCR檢測WNT1、WNT2、WNT2b, WNT3、WNT3a, WNT4,WNT9b, WNT10A，WNT10B基因在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常孕婦妊娠早孕期絨毛及蛻膜組織中的表達變化，篩選差異表達的WNT基因，構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HTR-8/SVneo細胞，檢測WNT配體對絨毛滋養(yǎng)細胞增殖、

13、遷移能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.WNT1、WNT2b、WNT3a、WNT4、WNT9b、WNT10A、WNT10B基因在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常妊娠絨毛及蛻膜組織的表達無顯著性差異(P＞0.05)，WNT2、WNT3在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜組織的表達顯著降低(P＜0.01)，在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和正常妊娠絨毛組織的表達無顯著差別(P＞0.05)。
　　2.用轉(zhuǎn)染W(wǎng)NT2、WNT3蛋白體外培養(yǎng)HTR-8/SVneo

14、細胞，細胞免疫熒光染色顯示HTR-8/SVneo細胞中β-catenin能像細胞核轉(zhuǎn)移并聚集，表明體外共培養(yǎng)WNT2、WNT3蛋白后，滋養(yǎng)層細胞內(nèi)wnt/β-catenin信號通路能被激活。
　　3.qPCR檢測共培養(yǎng)WNT2組18h后細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9、Cyclin D mRNA相對表達倍數(shù)較對照組分別上調(diào)了2.42、2.187、1.81倍（P＜0.05）;共培養(yǎng)WNT3組18h后細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9、Cycl

15、in D mRNA相對表達倍數(shù)較對照組分別上調(diào)了1.975、2.31、2.25倍（P＜0.05）;
　　4.Western檢測顯示共培養(yǎng)WNT2組細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9、CylinD蛋白表達量較對照組組上調(diào)2.12、2.9、2.45倍(P＜0.01);共培養(yǎng)WNT3組細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9、CylinD蛋白表達量較對照組上調(diào)2.3、1.87、1.76倍(P＜0.01);
　　5.MTT增殖試驗顯示，WNT2、WN

16、T3體外培養(yǎng)HTR-8/SVneo細胞后，細胞的增殖能力顯著增加。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，與含有WNT2蛋白的條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)18h后，滋養(yǎng)層細胞的遷移率為50％±3.1％，與含有WNT3蛋白的條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)18h，細胞遷移距離為45％±2.89％，而與無WNT蛋白的培養(yǎng)基共培養(yǎng)18h后，遷移率為23％±2.4％，兩組細胞的遷移率與對照相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者WNT2、WN