Wnt-β-catenin信號(hào)通路對(duì)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)早孕絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞調(diào)控及機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾個(gè)方面展開(kāi)論述：
　　第一部分 β-caten in及DDK1在URSA患者的絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜組織中表達(dá)
　　目的：
　　原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)在臨床上一直是比較難治療的不育疾病，占復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的60％-70％。研究發(fā)現(xiàn)許多信號(hào)途徑對(duì)早期成功妊娠很重要，其中Wnt信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)通路，在細(xì)胞的增殖、分

2、化、轉(zhuǎn)移、極性、粘附及干細(xì)胞的更新等過(guò)程起重要的調(diào)節(jié)作用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的適度激活可促進(jìn)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和子宮內(nèi)膜蛻膜化，為胚胎的成功著床提供條件，但目前其具體的調(diào)控機(jī)制仍未充分闡明。盡管有研究表明DDK1在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病人中表達(dá)上調(diào)，然而Wnt/β-catenin的異常表達(dá)與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系尚未充分闡明。本課題第一部分?jǐn)M通過(guò)研究β-catenin及DKK1(Dickkopf-l)在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)絨毛及

3、蛻膜組織中的表達(dá)情況，探討Wnt/β-catenin信號(hào)途徑在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的調(diào)控作用。
　　方法：
　　取不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常妊娠早孕絨毛及蛻膜組織各20例，本研究中選擇的所有不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者連續(xù)發(fā)生自然流產(chǎn)的次數(shù)均超過(guò)2次，患者年齡在26-36歲。正常流產(chǎn)患者為同期非意愿早期妊娠，主動(dòng)要求終止妊娠患者。用免疫組化及Western blot分別檢測(cè)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常孕婦妊娠早孕期絨毛及蛻膜組織中β-caten

4、in的定位及蛋白水平的表達(dá)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)蛻膜及絨毛組織中β-catenin和DDK1 mRNA的水平。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化顯示β-catenin主要分布在絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞膜上，部分分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，蛻膜組織中主要分布在腺體細(xì)胞的細(xì)胞膜上。不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者β-catenin表達(dá)水平低于正常流產(chǎn)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　2.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的絨毛和蛻膜組織中，West

5、ern結(jié)果顯示β-catenin蛋白表達(dá)顯著低于正常流產(chǎn)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，且絨毛及蛻膜組織中β-catenin低表達(dá)的患者分別占全部20名患者的70％(P＜0.001)及50％(P=0.0145)。
　　3.URSA患者絨毛和蛻膜組織中，β-catenin mRNA的相對(duì)表達(dá)水平顯著低于正常流產(chǎn)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，而DKK1 mRNA水平顯著高于正常流產(chǎn)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

6、001)。
　　結(jié)論：
　　正常妊娠及不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)絨毛及蛻膜組織中均可檢測(cè)到β-catenin及DKK1 mRNA，表明Wnt信號(hào)途徑在正常妊娠中起重要作用。β-catinin在正常早孕及不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者早孕絨毛的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞膜和細(xì)胞核表達(dá)，表明Wnt信號(hào)途徑參與了細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖過(guò)程。此外，在蛻膜組織的腺上皮表達(dá)也檢測(cè)到β-catinin的表達(dá)，Wnt信號(hào)途徑可能參與蛻膜組織的腺體在早孕期絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞入侵、胎

7、盤(pán)形成及胎兒的生長(zhǎng)過(guò)程。不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的絨毛和蛻膜組織的β-catinin表達(dá)顯著下調(diào)，而DKK1表達(dá)顯著上調(diào)，表明Wnt信號(hào)通路在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者是受抑制的，wnt/β-catinin表達(dá)下調(diào)可能是導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞增殖及侵襲受抑制，從而導(dǎo)致早期流產(chǎn)。Wnt信號(hào)通路的異常表達(dá)可能參與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的過(guò)程。
　　第二部分 Wnt信號(hào)分子對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖遷移的機(jī)制研究
　　背景：
　　作為Wnt信號(hào)通路最上游

8、的因子，Wnt配體對(duì)信號(hào)通路的激活起到一個(gè)開(kāi)關(guān)的作用。妊娠的不同時(shí)期絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜（蛻膜）在增生期和分泌期基質(zhì)和腺體細(xì)胞表達(dá)的Wnt配體也有所不同。10種Wnt配體及8種卷曲受體的在早孕胎盤(pán)組織中都有表達(dá)，但不同滋養(yǎng)細(xì)胞類型Wnt配體的表達(dá)有所不同，且隨孕周的增加其表達(dá)也會(huì)發(fā)生改變。WNT1，WNT7b，WNT10a和WNT10b，從早孕期到晚孕期表達(dá)逐漸下降;WNT1在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞均大量表達(dá)，WNT2、WNT

9、3在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞均中量表達(dá)，而WNT7b、WNT9b在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞大量表達(dá)，但在絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)顯著下調(diào)。表明WNT1、WNT2、WNT3對(duì)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的增生，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的分化和侵襲過(guò)程中起重要的作用。WNT2、WNT4、WNT5a、WNT7a、LRP6和β-catenin在子宮內(nèi)膜的增生期和分泌期表達(dá)相當(dāng)。wnt3在子宮內(nèi)膜增生期表達(dá)顯著高于分泌期。β-catenin在增生期和分泌期內(nèi)膜的腺體和基質(zhì)細(xì)胞均大量表達(dá)

10、。此外，研究發(fā)現(xiàn)WNT2，WNT4，WNT5a，WNT7a，WNT8b，和WNT3，可通過(guò)月經(jīng)周期的變化而調(diào)節(jié)，通過(guò)旁分泌的形式影響絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的功能。這些結(jié)果都表明Wnt/β-catenin及DKK1的表達(dá)在絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、遷移及胚胎植入過(guò)程中起重要作用。
　　目的：
　　前期研究不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者Wnt信號(hào)通路是受抑制的。但是究竟哪些關(guān)鍵性的Wnt配體異常表達(dá)會(huì)影響不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖能力

11、和侵襲能力降低，目前還不是很清楚;本項(xiàng)目擬在前期工作的基礎(chǔ)上，采用各種細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)方法對(duì)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞差異Wnt配體進(jìn)行篩選，揭示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞增生、遷移作用的分子學(xué)機(jī)制，從新的角度探索不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制，為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療篩選出高效的靶基因。
　　方法：
　　取不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常妊娠早孕絨毛及蛻膜組織各20例，本研究中選擇的

12、　　所有URSA患者連續(xù)發(fā)生自然流產(chǎn)的次數(shù)均超過(guò)2次，患者年齡在26-36歲。正常流產(chǎn)患者為同期非意愿早期妊娠，主動(dòng)要求終止妊娠患者。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)WNT1、WNT2、WNT2b, WNT3、WNT3a, WNT4,WNT9b, WNT10A，WNT10B基因在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常孕婦妊娠早孕期絨毛及蛻膜組織中的表達(dá)變化，篩選差異表達(dá)的WNT基因，構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HTR-8/SVneo細(xì)胞，檢測(cè)WNT配體對(duì)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、

13、遷移能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.WNT1、WNT2b、WNT3a、WNT4、WNT9b、WNT10A、WNT10B基因在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常妊娠絨毛及蛻膜組織的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，WNT2、WNT3在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜組織的表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和正常妊娠絨毛組織的表達(dá)無(wú)顯著差別(P＞0.05)。
　　2.用轉(zhuǎn)染W(wǎng)NT2、WNT3蛋白體外培養(yǎng)HTR-8/SVneo

14、細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光染色顯示HTR-8/SVneo細(xì)胞中β-catenin能像細(xì)胞核轉(zhuǎn)移并聚集，表明體外共培養(yǎng)WNT2、WNT3蛋白后，滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)wnt/β-catenin信號(hào)通路能被激活。
　　3.qPCR檢測(cè)共培養(yǎng)WNT2組18h后細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9、Cyclin D mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)較對(duì)照組分別上調(diào)了2.42、2.187、1.81倍（P＜0.05）;共培養(yǎng)WNT3組18h后細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9、Cycl

15、in D mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)較對(duì)照組分別上調(diào)了1.975、2.31、2.25倍（P＜0.05）;
　　4.Western檢測(cè)顯示共培養(yǎng)WNT2組細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9、CylinD蛋白表達(dá)量較對(duì)照組組上調(diào)2.12、2.9、2.45倍(P＜0.01);共培養(yǎng)WNT3組細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9、CylinD蛋白表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)2.3、1.87、1.76倍(P＜0.01);
　　5.MTT增殖試驗(yàn)顯示，WNT2、WN

16、T3體外培養(yǎng)HTR-8/SVneo細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖能力顯著增加。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與含有WNT2蛋白的條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)18h后，滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移率為50％±3.1％，與含有WNT3蛋白的條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)18h，細(xì)胞遷移距離為45％±2.89％，而與無(wú)WNT蛋白的培養(yǎng)基共培養(yǎng)18h后，遷移率為23％±2.4％，兩組細(xì)胞的遷移率與對(duì)照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者WNT2、WN