不明原因復發(fā)性自然流產(chǎn)中Tim-3-Gal-9通路介導的免疫失衡機制研究.pdf

1、第一部分Tim-3和Gal-9在小鼠母胎界面的表達
　　【目的】
　　檢測Tim-3和Gal-9在小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型母胎界面的表達,探討Tim-3-Gal-9通路與不明原因復發(fā)性自然流產(chǎn)的聯(lián)系。
　　【方法】
　　1.將CBA/J雌鼠分別與DBA/2、BALB/c雄鼠2:1合籠,分別構(gòu)建小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型。
　　2.采用Western blot、Real-Time PCR和流式細胞術(shù)

2、檢測小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型胎盤組織Tim-3和Gal-9的表達。
　　3.采用免疫組織化學、Westernblot、Real-TimePCR和流式細胞術(shù)檢測小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型蛻膜組織Tim-3和Gal-9的表達。
　　【結(jié)果】
　　1.小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型造模成功。
　　2.小鼠自然流產(chǎn)模型胎盤組織中Tim-3蛋白和mRNA的表達高于正常妊娠模型,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3、
　　3.小鼠自然流產(chǎn)模型的滋養(yǎng)細胞Tim-3+細胞百分比高于正常妊娠模型,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　4.Tim-3在小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型蛻膜組織中均有表達,且主要表達在細胞胞漿和細胞膜,小鼠自然流產(chǎn)模型蛻膜組織Tim-3蛋白表達水平高于正常妊娠模型,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而兩組模型蛻膜組織Tim-3mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　5.①小鼠自然流產(chǎn)模型和正常

4、妊娠模型的蛻膜基質(zhì)細胞Tim-3+細胞百分比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　②小鼠自然流產(chǎn)模型的蛻膜腺上皮細胞Tim-3+細胞百分比高于小鼠正常妊娠模型,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　③小鼠自然流產(chǎn)模型的蛻膜淋巴細胞Tim-3+細胞百分比低于小鼠正常妊娠模型,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　6.小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型胎盤組織中Gal-9mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。<

5、br>　　7.小鼠自然流產(chǎn)模型的滋養(yǎng)細胞Gal-9+細胞百分比低于正常妊娠模型,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　8.Gal-9在小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型蛻膜組織中均有表達,且主要表達在細胞胞漿和細胞膜,小鼠兩組模型蛻膜組織中Gal-9蛋白和mRNA的表達水平差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　9.①小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型的蛻膜基質(zhì)細胞Gal-9+細胞百分比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　

6、?、谛∈笞匀涣鳟a(chǎn)模型的蛻膜腺上皮細胞Gal-9+細胞百分比低于正常妊娠模型,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　?、坌∈笞匀涣鳟a(chǎn)模型的蛻膜淋巴細胞Gal-9+細胞百分比低于正常妊娠模型,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　【結(jié)論】
　　Tim-3和Gal-9在小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型的母胎界面均有表達,且當Tim-3和/或Gal-9表達異常時,可能導致復發(fā)性自然流產(chǎn)。
　　第二部分體外研究Tim-3-

7、Gal-9通路對淋巴細胞免疫應答的調(diào)節(jié)機制
　　【目的】
　　將小鼠脾臟淋巴細胞、外周血淋巴細胞分別與滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng),以探討Tim-3-Gal-9通路對淋巴細胞免疫應答調(diào)節(jié)的分子機制。
　　【方法】
　　1.用流式細胞術(shù)檢測小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型脾臟淋巴細胞及外周血淋巴細胞的Tim-3和Gal-9表達。
　　2.采用ELISA檢測小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型血清中Th1型細胞因子IFN-γ和IL-

8、2,Th2型細胞因子IL-4的表達。
　　3.將小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型脾臟淋巴細胞、外周血淋巴細胞分別與各自的滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng),于共培養(yǎng)的第0、1、2、3、4、5、6、8、10天采用CFSE標記法檢測淋巴細胞增殖情況,同時采用流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞上Tim-3和Gal-9的表達,并分別于共培養(yǎng)的第1、3、6、10天采用ELISA檢測共培養(yǎng)體系上清中Th1型細胞因子IFN-γ和IL-2,Th2型細胞因子IL-4的表達。

9、　　【結(jié)果】
　　1.小鼠自然流產(chǎn)模型的外周血淋巴細胞Tim-3+細胞百分比高于正常妊娠模型,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);小鼠自然流產(chǎn)模型的外周血淋巴細胞Gal-9+細胞百分比低于正常妊娠模型,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組模型的小鼠脾臟淋巴細胞Tim-3+細胞百分比和Gal-9+細胞百分比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　2.小鼠自然流產(chǎn)模型血清中Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ的表達比正常妊

10、娠模型低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),兩組模型血清中Th2型細胞因子IL-4差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3.小鼠自然流產(chǎn)模型脾臟淋巴細胞-滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)體系中淋巴細胞增殖率于第1~10天均明顯低于正常妊娠模型,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);外周血淋巴細胞-滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)體系結(jié)果與脾臟淋巴細胞相同(P<0.05)。
　　4.小鼠自然流產(chǎn)模型脾臟淋巴細胞-滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)體系中脾臟淋巴細胞Tim-3+細胞百

11、分比與正常妊娠模型相比先升高然后逐漸降低,分別于第1天和第5天差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);外周血淋巴細胞-滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)體系結(jié)果與脾臟淋巴細胞相同,分別于第0、1天和第5、6天差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　5.小鼠自然流產(chǎn)模型脾臟淋巴細胞-滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)體系中脾臟淋巴細胞Gal-9+細胞百分比與正常妊娠模型相比先下降然后逐漸升高,分別于第1、4、5、6天和第8天差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);外周血淋巴細胞-滋養(yǎng)

12、細胞共培養(yǎng)體系結(jié)果與脾臟淋巴細胞相同,分別于第0、3天和第6天差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　6.小鼠自然流產(chǎn)模型脾臟淋巴細胞-滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)體系上清中Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ的表達高于正常妊娠模型,且于第6天差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),Th2型細胞因子IL-4的表達低于正常妊娠模型,且于第1、3、6天差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。小鼠自然流產(chǎn)模型外周血淋巴細胞-滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)體系中IL-2和IFN-