脊髓進行性壓迫致內質網(wǎng)應激細胞凋亡的機制研究.pdf

1、第一部分大鼠脊髓進行性壓迫性損傷實驗模型的建立 目的:脊髓進行性壓迫是脊柱外科領域最常見的一種致病因素；其病理機制既包含逐漸加重的機械性損傷，又存在著脊髓缺血性損傷。頸椎病脊髓型、髓外腫瘤、后縱韌帶骨化以及脊柱結核等疾病，均可引起脊髓壓迫性損傷，但迄今為止對其機制的研究尚缺乏一個理想的實驗動物模型。因此，建立一個科學的大鼠脊髓壓迫性損傷實驗動物模型，可為脊髓受壓后的基本病理生理過程及其分子機制的研究奠定基礎。 方法:

2、 ①解剖大鼠椎骨椎管，觀察大鼠椎骨及脊柱的形態(tài)特點，脊髓與椎骨的對應關系。根據(jù)大鼠椎骨及脊柱結構特點，為脊髓壓迫器的設計尋找適宜的支撐點； ②根據(jù)大鼠脊柱結構特點自行設計大鼠脊髓壓迫器。用自行設計的壓迫器制作大鼠進行性壓迫實驗動物模型； ③觀察大鼠行為學的變化； ④運用影像學、HE和Nissel氏染色、TTC等方法，評價該模型的可靠性。 結果: ①大鼠脊髓腰膨大位于第一腰椎椎體后方，大鼠脊髓圓

3、錐平面較低，約平第三腰椎。 ②胸腰椎的椎板上各有一對呈楔狀的前關節(jié)突和兩對后關節(jié)突，即一對后上關節(jié)突和一對后下關節(jié)突，后位椎骨的前關節(jié)突與前位椎骨的上、下后關節(jié)突相鑲合，形成穩(wěn)定的關節(jié)。 ③從第10胸椎開始至第5腰椎為止，其棘突由后下伸向前上。根據(jù)以上三個解剖結構特點自制脊髓壓迫器制作模型。壓迫器包括三個部分：模擬L1椎板固定部分、壓迫鋼板、螺絲釘。 ④隨著脊髓壓迫程度和壓迫時間的增加，逐漸出現(xiàn)大鼠肌力減退、行動

4、緩慢，后肢癱瘓，大小便失禁。 ⑤TTC、腿和Nissel染色結果顯示，在各時間段均可見脊髓缺血，其范圍與壓迫時間及壓迫強度相關；脊髓缺血嚴重的區(qū)域組織出現(xiàn)水腫、神經(jīng)元空泡化、白質疏網(wǎng)狀改變及退行性變；而脊髓缺血較輕的區(qū)域神經(jīng)元和膠質細胞的形態(tài)學改變主要為尼氏體減少甚至消失等改變。 結論: ①大鼠胸腰段的結構特點為脊髓壓迫器的固定提供了理想的力學支撐點，為自行設計脊髓壓迫器提供了形態(tài)學基礎。 ②自行設計的脊

5、髓壓迫器具有結構合理、固定牢固、易于安裝等優(yōu)點。 ③用自制大鼠脊髓壓迫器制作而成的大鼠脊髓進行性壓迫模型，可復制脊髓壓迫性損傷的病理過程，具有方法簡單、科學、重復性強等特點。 ④脊髓壓迫程度可根據(jù)實驗目的不同進行調節(jié)。 ⑤自行設計的脊髓壓迫器是研究脊髓慢性壓迫性損傷機制的理想實驗動物模型。 ⑥術后行為學、影像學、TTC及組織學觀察發(fā)現(xiàn)，脊髓進行性壓迫損傷的行為學和病理學改變與臨床脊髓進行性壓迫損傷基本相同

6、。 第二部分大鼠脊髓進行性壓迫性損傷Caspase-12表達與細胞凋亡 目的：觀察大鼠脊髓進行性壓迫性損傷組織中細胞凋亡、Caspase-12的表達變化規(guī)律以及細胞超微結構的變化，探討脊髓進行性壓迫性損傷細胞凋亡的分子機制。 方法： ①隨機選用健康成年wiser大鼠120只，雌雄不拘，體質量250-300g。隨機將動物分為兩組：脊髓進行性壓迫組共計60只，每個時間點10只；假手術組60只，每個時間點10只

7、。 ②按照自行設計的方法，制作動物脊髓壓迫模型；假手術組只作全椎板切除，不作脊髓壓迫。 ③于術后第1、3、7、14、21、28d取出脊髓，運用Tunel染色、免疫組化、Western bloting、電鏡技術等方法觀察脊髓進行性壓迫性損傷后，脊髓的病理變化和內質網(wǎng)的形態(tài)學改變、細胞凋亡及Caspase-12的表達變化的規(guī)律，以探討其相互間的關系。 ④計算機圖像分析系統(tǒng)和SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件對所得的圖像和

8、數(shù)據(jù)進行分析。 結果： ①電鏡結果顯示，細胞形態(tài)改變主要為：胞質皺縮、核膜皺折、異染色質邊聚、核濃縮等改變；也可見不同程度的細胞腫脹，線粒體腫脹、內質網(wǎng)腫脹及內質網(wǎng)模溶解等變化。在各壓迫時間段均可見神細胞內質網(wǎng)結構不同程度的改變。 ②Tunel染色顯示脊髓受壓早期，即可見細胞凋亡，隨著壓迫時間的延長，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞凋亡數(shù)量明顯增加。細胞凋亡的發(fā)生率在1、3、7、14、21、28d分別為：(12.5±2.3)

9、％、(13..±3.6)％、(17.2±4.3)％、(17.2±4.3)％、(36.1±6.5)％、(2.3±7.9)％。手術組與假手術組間比較有顯著性差異(P<0.05)； ③而與此相對應，Caspase-12的陽性細胞于術后1、3、7、14、21、28d表達分別為(18,47±2,16)、(22.03±2.53)、(25.12±3.12)、(30.70±4.26)、(31.37±4.82)、(26.62±3.84)個，手術組

10、與假手術組間比較有顯著性差異(P<0.05))；顯示凋亡的發(fā)生率與Caspase-12的表達增強而增加。 ④western blotting結果提示Caspase-12的蛋白表達隨脊髓壓迫時間延長和程度的加重而增強，手術組與假手術組間比較有顯著性差異(P<0.05)。 ⑤表明Caspase-12表達與細胞凋亡的時空變化規(guī)律相一致。 結論：在脊髓進行性壓迫過程中，神經(jīng)細胞凋亡是引起脊髓損傷的主要病理因素，細胞凋亡誘

11、導了脊髓繼發(fā)性退行性變，Caspase-12可能參與了脊髓進行性壓迫性損傷所導致的細胞凋亡。 第三部分脊髓進行性壓迫致內質網(wǎng)途徑細胞凋亡信號轉導的機制研究 目的:觀察脊髓進行性壓迫性損傷神經(jīng)細胞內Ca<'2+>濃度、Irel、Grp78及Caspase-12的表達變化規(guī)律；以探討脊髓壓迫缺血性損傷內質網(wǎng)應激所致細胞凋亡信號轉導途徑的意義，以期為臨床干預性治療提供實驗基礎。 方法:成年Wistar大鼠，隨機分為手術

12、組和假手術組，按照本文作者自行設計的方法制作大鼠脊髓壓迫模型；假手術組，只作全椎板切除，不做脊髓壓迫，分別于術后1、3、7、14、21、28d取出脊髓。 運用生物化學、免疫組化、Western bloting、RT-PCR和圖像分析等方法觀察脊髓進行性壓迫缺血性損傷后，脊髓神經(jīng)細胞內Ca<'2+>的濃度、Irel、Grp78及Caspase-12的表達變化規(guī)律。 結果:行脊髓進行性壓迫后，神經(jīng)細胞內Ca<'2+>濃度于術

13、后1、3、7、14、21、28d均呈現(xiàn)升高趨勢；各時間段神經(jīng)細胞內Ca<'2+>的濃度分別為：371.78±69.35；383.26±10.47；402.6±62.23；417.15±67.56；313.34±12.39；297.45±28.71 nmol/L。手術組與假手術組比較有顯著性差異(P<0.05)。Grp78 mRNA和Grp78檢測結果顯示，在脊髓進行性壓迫各組Grp78mRNA和Grp78均呈現(xiàn)出相同的表達增高趨勢，于7

14、d到達峰值，于術后14、21、28 d Grp78 mRNA的表達仍處于較高水平，而Grp78蛋白的表達水平卻逐漸下降；手術組與假手術組比較有顯著性意義(P<0.05)。Ire1 mRNA和Ire1檢測發(fā)現(xiàn)，術后1d即有較高水平表達。術后3、7、14d Ire1 mRNA和Ire1的表達呈迅速增高，術后21、28d Ire1mRNA和Ire1的表達均逐漸下降，手術組與假手術組比較有顯著性差異(P<0.05)。Caspase-12 mRN

15、A和Caspase-12的表達于術后1、3、7、14 d逐漸升高，并分別于14、21d達到峰值。術后28 d Caspase-12mRNA和Caspase-12的表達均下降。手術組與假手術組比較有顯著性意義(P<0.05)。 結論: (1)脊髓進行性壓迫缺血性損傷導致細胞內Ca<'2+>濃度升高而引起內質網(wǎng)應激； (2)Ire1的表達標志著內質網(wǎng)上未折疊蛋白積聚以及相關蛋白的表達增加； (3)Grp78的