內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在2型糖尿病動脈粥樣硬化小鼠脂肪肝形成中的機制探討.pdf

1、糖尿病是一類由遺傳、環(huán)境以及免疫等因素引起的以高血糖為特征的代謝性疾病，它主要分為1型和2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)兩種類型，其中T2DM患者占90％左右。T2DM的主要特征是周圍組織的胰島素抵抗(insulin resistant，IR)和胰島β細胞分泌胰島素相對不足。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是T2DM和肥胖的一種較為常

2、見的肝臟并發(fā)癥。目前NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子機制尚未完全明確。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是一種由于內(nèi)外界環(huán)境變化和刺激而導致的錯誤折疊與未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集以及Ca2+平衡紊亂的狀態(tài)。ERS對決定應激細胞的結局如抵抗、適應、損傷或凋亡發(fā)揮重要作用。近年來有關ERS信號通路與效應的研究非?；钴S。研究表明ERS在IR、T2DM以及脂肪肝的形成過程中具有重要的作用。ERS可

3、能通過影響糖脂代謝相關基因如固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白(sterol regulatory elementbinding proteins—lc，SREBP—lc)等的表達，增加肝臟內(nèi)脂肪酸的合成和積聚。同時ERS在肝細胞載脂蛋白B100(apolipo—protein B100，apoB100)的合成和分泌過程中也具有重要的調(diào)節(jié)作用，影響和制約著肝細胞內(nèi)極低密度脂蛋白的分泌，進而引起肝臟脂質(zhì)的積累。目前，針對ERS在T2DM患者(人及動物)

4、脂肪肝發(fā)生過程中的作用機制的研究開始時間不長，ERS相關因子在脂肪肝發(fā)生過程中的作用機制尚不明確，仍需深入探討。 因此，為了探討并論證ERS在T2DM脂肪肝發(fā)生發(fā)展的分子機制，本實驗通過高脂飲食喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導，在低密度脂蛋白受體基因缺失(LDLR—/—)小鼠的基礎上建立了一種T2DM動脈粥樣硬化小鼠模型。我們應用實時定量RT—PCR技術檢測該模型小鼠與非糖尿病的單純動脈粥樣硬化(L

5、DLR—/—)小鼠肝細胞ERS和脂代謝相關基因表達差異，并進行血生化指標檢測及肝臟形態(tài)學觀察。綜合分析、探討了ERS在T2DM小鼠脂肪肝形成和發(fā)展中的作用機制，為T2DM脂肪肝的預防和治療，提供有價值的參考依據(jù)。 1.T2DM動脈粥樣硬化小鼠模型的建立 我們選用3周齡雄性LDLR—/—小鼠，分成四組：組I普通飼料對照組(普通飼料+檸檬酸，即CHOW+P)：組II普通飼料實驗組(普通飼+STZ，即CHOW+STZ)；組II

6、I高脂飼料對照組(高脂肪飼料+檸檬酸，即HF+P)；組Ⅳ高脂飼料實驗組(高脂肪飼料+STZ，即HF+STZ)。首先各組小鼠喂以相應飼料3周，于6周齡時禁食12h后，組II和組IV小鼠按照100 mg/kg體重的劑量，腹腔注射STZ溶液；組I和組III小鼠腹腔注射相應體積的0.1mol/L無菌檸檬酸緩沖液。全部小鼠注射完畢后，繼續(xù)飼喂相應飲食。待小鼠生長至10周齡時禁食12h檢測血糖( glucose，GLU)和血清胰島素(insulin

7、，INS)水平，并計算胰島素抵抗(insulin resistant，IR)指數(shù)，進行葡萄糖耐量試驗。結果表明，與其它組相比，HF+ STZ組小鼠在10周齡時表現(xiàn)為高GLU、葡萄糖耐量異常以及IR增強，同時血清總膽固醇(totle cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)和游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)水平顯著升高(P＜0.01)，這表明我們已經(jīng)在LDLR—/—基礎上成功建立了T2

8、DM動脈粥樣硬化小鼠模型。 2.T2DM相關指標的測定 T2DM動脈粥樣硬化成模小鼠(10周齡)及非糖尿病對照組小鼠(ND)繼續(xù)喂喂以相應飲食，分別在10、14、18、26和34周齡解剖取材，進行如下指標的測定，結果如下： 1)血生化指標檢測：與ND小鼠相比，T2DM小鼠10周齡時表現(xiàn)為高GLU、葡萄糖耐量異常以及IR增強，并持續(xù)至34周齡。該組小鼠血清TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity li

9、poprotein cholesterol，LDL—C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoproteincholesterol，HDL—C)和FFA含量于10周齡時較ND小鼠明顯升高，并持續(xù)升高至34周齡。T2DM小鼠血清apoB100含量在10周齡時明顯高于同齡ND小鼠(P＜0.01)，18、26及34周齡時低于ND小鼠(P＜0.05)。肝功能指標血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine amino transfer

10、ase，ALT)及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate amino transferase，AST)分別從10和14周齡時顯著升高(P＜0.01)，持續(xù)升高至34周齡。從10周齡時T2DM小鼠肝臟TC和TG含量較ND組小鼠顯著升高，并持續(xù)至34周齡(P＜0.01)。 2)肝臟病理形態(tài)檢測：中性脂肪染色(油紅O染色)顯示，T2DM小鼠10和14周齡時肝細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴，呈現(xiàn)肝脂肪變性。18、26和34周齡時脂肪肝病變

11、程度加重，并伴有局部炎癥細胞浸潤。各年齡段的ND小鼠肝臟組織結構完整，小葉結構清晰，肝細胞內(nèi)均未觀察到明顯的脂質(zhì)沉積。 3)基因表達變化特征：與ND小鼠相比，T2DM組小鼠10周齡時肝臟ERS相關因子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78，GRP78)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94( glucose regulatedprotein94，GRP94)、轉(zhuǎn)錄激活因子(activating transcri

12、ption factor4，ATF4)、X盒結合蛋白1( X—box binding protein1，XBP1)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)和tribbles同源蛋白3(tribbles—related protein3，TRB3)表達水平明顯升高，并持續(xù)到34周齡(P＜0.05)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關性降解因子內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖苷酶1樣蛋白(ER degradation enhancer，man

13、nosidase alpha—like1，EDEM1)、DnaJ C類超家族同源蛋白3[DnaJ(Hsp40) homolog，subfamily C，member3，P58IPK]和熱擊蛋白70(heat shock protein70，Hsp70)的表達水平在18和34周齡，較ND小鼠顯著升高(P＜0.05)。 與ND小鼠相比，T2DM組小鼠脂代謝調(diào)控因子糖調(diào)節(jié)元件結合蛋白(carbohydrateresponse elem

14、ent binding protein，ChREBP)、SREBP-1c及生脂基因乙酰輔酶A羧化酶α(acetyl CoA carboxylasea，ACCα)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)和硬脂酰基輔酶A脫氫酶-1(Stearoyl—CoA desaturase-1，SCD-1)的表達顯著升高(P＜0.05)。糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK3β)、apoB100及

15、甘油—3—磷酸轉(zhuǎn)酰酶(glycerolphosphate acyltransferase，GPAT)的表達水平在10、18和34周齡時較ND小鼠明顯升高(P＜0.05)。T2DM組小鼠轉(zhuǎn)錄因子肝X受體α(liver X receptorα，LXRα)和乙酰輔酶A羧化酶β(acetyl CoA carboxylaseβ，Accβ)在10和18周齡時較ND小鼠顯著升高(P＜0.05)。 ERS通過H調(diào)GSK3p、SREBP-1c、