Rho激酶與PARP在乳鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡中關(guān)系的研究.pdf

1、隨著人們生活方式改變和人口老齡化，心血管疾病已經(jīng)成為威脅人類生命健康的頭號(hào)殺手，WHO2008年世界衛(wèi)生報(bào)告顯示世界范圍內(nèi)冠心病居人類死亡原因第一位，人們公認(rèn)最有效的冠心病治療原則是盡快恢復(fù)血液灌注，但近年來(lái)各種研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血后再灌注會(huì)加重受損心肌細(xì)胞功能及結(jié)構(gòu)的破壞，即缺血再灌注（Ischemia and reperfusion injury，I/R）損傷。明確I/R損傷的機(jī)制，盡早恢復(fù)“罪犯”血管灌注同時(shí)減輕再灌注損傷是臨床上新的

2、挑戰(zhàn)。 近來(lái)，Rho激酶（ROCK）與多聚ADP核糖聚合酶（PARP）在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的研究中受到廣大科研工作者的關(guān)注。 Rho激酶與細(xì)胞的形態(tài)、黏附、轉(zhuǎn)移、增生、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡等多種生物學(xué)行為密切相關(guān)。根據(jù)發(fā)生凋亡的細(xì)胞類型及觸發(fā)凋亡的刺激不同，Rho激酶既可以作為促凋亡因子也可以作為抑制凋亡因子參與細(xì)胞凋亡。最新研究表明RhoA/Rho激酶過(guò)度表達(dá)可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，繼而通過(guò)caspase相關(guān)通路導(dǎo)致心肌

3、細(xì)胞凋亡。我們前期研究在大鼠心肌缺血再灌注模型證明：缺血再灌注時(shí)，Rho激酶明顯上調(diào)，應(yīng)用Rho激酶抑制劑可以顯著減少心肌梗死面積，降低心肌細(xì)胞凋亡率，研究還表明Rho激酶通過(guò)JNK/AIF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路發(fā)揮作用。 PARP是一個(gè)酶家族，具有蛋白修飾和核苷酸聚合作用。對(duì)于正?；駾NA輕度受損的細(xì)胞，PARP幫助修復(fù)DNA，維持基因組穩(wěn)定。但大量或過(guò)強(qiáng)的DNA損傷，PARP被過(guò)渡激活，造成ATP耗竭，最終細(xì)胞因DNA的

4、修復(fù)不敵能量的消耗而死亡。研究證明各種刺激可激活caspase家族裂解其底物PARP，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。我們前期研究表明在大鼠I/R損傷中，PARP激活導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增加，應(yīng)用PARP抑制劑對(duì)I/R心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。PARP通過(guò)JNK來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)AIF的作用。PARP/JNK/AIF信號(hào)通路是介導(dǎo)大鼠心臟I/R損傷的一條重要的通路。 心肌細(xì)胞缺血再灌注時(shí)，Rho激酶與PARP都是細(xì)胞凋亡相關(guān)的細(xì)胞因子，兩者作用都與caspas

5、e細(xì)胞凋亡通路以及JNK/AIF信號(hào)通路相關(guān)，但兩者是否存在相互關(guān)系，相互關(guān)系如何，以及兩者通過(guò)何種機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞凋亡目前尚不清楚。本研究擬建立模擬心肌細(xì)胞缺血再灌注模型，分別應(yīng)用Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾和PARP抑制劑3—AB，測(cè)定Rho激酶與PARP在心肌細(xì)胞中的表達(dá)以及心肌細(xì)胞凋亡率，從而明確Rho激酶與PARP在心肌細(xì)胞凋亡中的作用以及兩者之間的關(guān)系。這對(duì)闡明缺血再灌注導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機(jī)制具有重要意義，可能為防治缺血再灌注損傷提

6、供新的治療靶點(diǎn)。 目的: （1）觀察Rho激酶與PARP在心肌I/R損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡中的作用。 （2）探討Rho激酶與PARP在心肌I/R損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡中的相互關(guān)系。 方法: 培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，建立缺血再灌注損傷模型。實(shí)驗(yàn)分四組：空白對(duì)照組：細(xì)胞正常培養(yǎng)4天。I/R組：細(xì)胞正常培養(yǎng)4天，第5天建立缺血再灌注模型。I/R+3—AB組：細(xì)胞正常培養(yǎng)4天，建模前用PARP抑制劑3—AB預(yù)處理細(xì)

7、胞1h，藥物終濃度3mmol/L。I/R+F組：細(xì)胞正常培養(yǎng)4天，建模前用Rho—激酶抑制劑鹽酸法舒地爾預(yù)處理細(xì)胞1h，藥物終濃度100μmol/L。Western blot分別檢測(cè)各組MYPT—1磷酸化水平（P—MYPT—1）及PARP—1蛋白表達(dá)量，以MYPT—1磷酸化水平代表Rho激酶的活化程度。應(yīng)用流式細(xì)胞儀Annexin—V/PI雙色法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果: 1、心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：接種4—8h心肌細(xì)

8、胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，24 h細(xì)胞已全部貼壁，貼壁后為梭形，菱形或多角形，第2天細(xì)胞逐漸在瓶底表面鋪展，并伸出偽足，形成不規(guī)則的星形并相互接觸交織成網(wǎng)第3天細(xì)胞逐漸連接成片形成致密單層，開(kāi)始出現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)，頻率約45次/min。第4天可形成呈放射狀排列的細(xì)胞簇，搏動(dòng)已同步化，約70次/min，收縮明顯有力。 2、Western blot檢測(cè)PARP和Rho激酶蛋白表達(dá)趨勢(shì)：以MYPT—1磷酸化程度來(lái)代表Rho激酶活化程度。PA

9、RP相對(duì)表達(dá)量和MYPT—1磷酸化程度分別以PARP和P—MYPT—1與β—action蛋白電泳條帶灰度值的比值表示。缺血1h再灌注3h后，I／R組與對(duì)照組相比，Rho激酶活化程度和PARP表達(dá)都明顯增加（P<0.05），提示兩者在缺血再灌注情況下都顯著激活，同時(shí)證明缺血再灌注模型建立成功；與I/R組相比：I/R+3—AB組PARP的表達(dá)顯著降低（P<0.05），而Rho激酶蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著變化（p>0.05），提示PARP抑制劑3—A

10、B可以有效抑制PARP蛋白表達(dá)，但對(duì)Rho激酶蛋白沒(méi)有影響。I/R+F組不但PARP的表達(dá)顯著降低（P<0.05），而且Rho激酶蛋白表達(dá)也顯著降低（P<0.05）。提示Rho激酶抑制劑不但可以有效抑制Rho激酶蛋白表達(dá)也可以有效抑制PARP表達(dá)。因此Rho激酶可能是PARP的上游調(diào)節(jié)因子。I/R+3—AB組與I/R+F組相比較：PARP蛋白的表達(dá)沒(méi)有顯著變化（P>0.05），而I/R+F組Rho激酶蛋白表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于I/R+3—AB組，

11、有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（P<0.05）。 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：I/R組心肌細(xì)胞凋亡率為（8.89±0.94）%，與對(duì)照組相比心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0.05）；I/R+3—AB組與I/R+F組中心肌細(xì)胞凋亡率分別為（6.92±1.22）%、（3.93±0.61）%，與I/R組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示3—AB和鹽酸法舒地爾都可以顯著抑制缺血再灌注損傷中心肌細(xì)胞凋亡。I/R+3—AB組與I/R+F組相比P<

12、0.05，提示法舒地爾對(duì)缺血再灌注中心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用明顯強(qiáng)于3—AB。由于這兩組PARP蛋白表達(dá)量無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此提示除外PARP途徑，Rho激酶可能還通過(guò)其他途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 結(jié)論: 1、在大鼠心臟I/R損傷中，Rho激酶和PARP都被顯著激活，兩者都有促心肌細(xì)胞凋亡作用。 2、Rho激酶與PARP在大鼠心臟I/R損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡過(guò)程中有相關(guān)。 3、Rho激酶是PARP的上游調(diào)節(jié)因子，抑制