利拉魯肽對高糖條件下SD乳鼠心肌細胞P38MAPK信號通路作用的研究.pdf

1、目的:糖尿病性心肌病(DCM)作為糖尿病獨立的心血管并發(fā)癥日益受到重視。心肌細胞凋亡在糖尿病心肌病的形成中起到重要作用，最終發(fā)展為充血性心功能衰竭。目前還沒有措施能夠阻止糖尿病心肌病的形成和進展。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是由腸道內(nèi)分泌細胞L細胞分泌的一種重要的腸促胰島素，GLP-1類似物-利拉魯肽作為降糖藥物已廣泛的應用于臨床，其胰腺外作用特別是對心肌細胞的作用是目前糖尿病領(lǐng)域關(guān)注的熱點。本實驗旨在探討GLP-1類似物利拉魯肽對

2、SD乳鼠心肌細胞在高糖條件下的作用及其可能的機制。
　　方法:
　　1、SD乳鼠心肌細胞的提取:取1-3天齡的健康SD(SpragueDawley)大鼠乳鼠20只，處死后取心尖，應用胰酶及Ⅱ型膠原酶消化法提取細胞，通過差速貼壁法純化心肌細胞，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后換液繼續(xù)培養(yǎng)24小時，此時可觀察到心肌細胞貼壁良好且偽足相互接觸交織成網(wǎng)并呈現(xiàn)同步搏動，通過倒置相差顯微鏡形態(tài)學觀察以及熒光法進行鑒定。
　　2、分組干

3、預:將培養(yǎng)72小時的心肌細胞分7組分別為正常糖組(5.5mmol/L葡萄糖)、高滲對照組(5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇)、高糖對照組（25.0mmol/L葡萄糖）、高糖+低濃度利拉魯肽組（25.0mmol/L葡萄糖+50nmol/L利拉魯肽）、高糖+中濃度利拉魯肽組（25.0mmol/L葡萄糖+100nmol/L利拉魯肽）、高糖+高濃度利拉魯肽組（25.0mmol/L葡萄糖+200nmol/L利拉魯肽）、正常糖+

4、高濃度利拉魯肽組(5.5mmol/L葡萄糖+200nmol/L利拉魯肽)。將7組細胞在不含胎牛血清的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)72小時進行以下操作(48小時換液)。
　　3、細胞凋亡檢測:將7組細胞干預72小時后酒精固定，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　4、蛋白表達的測定:將7組細胞干預72小時后提取蛋白，用Westernblot檢測凋亡蛋白caspase-3及P-P38MAPK/P38MAPK。
　　5、數(shù)據(jù)分析:所得數(shù)據(jù)采

5、用均數(shù)±標準差(x±s)表示，統(tǒng)計分析運用SPSS13.0軟件。多個樣本均數(shù)間的比較用方差分析(One-wayANOVA)，均數(shù)間的兩兩比較用q檢驗。P＜0.05為有意義;P＜0.01為有顯著意義。
　　結(jié)果:
　　1、一般指標觀察:與低糖對照組心肌細胞相比，高糖對照組心肌細胞生長狀態(tài)較差，搏動減弱，利拉魯肽干預組介于正常糖組及高糖組之間，高滲組及正常糖+高濃度利拉魯肽組同對照組無明顯差別。
　　2、凋亡率:高糖對照組

6、較正常糖組心肌細胞凋亡率明顯增加(19.39±1.37％vs3.33±0.32％，P＜0.01)，利拉魯肽干預組較高糖組比較凋亡率均有明顯降低（P＜0.01），但均高于正常糖組(P＜0.01)，高糖+高濃度利拉魯肽組凋亡率低于高糖+低、中濃度利拉魯肽組(7.11±1.42％vs12.02±0.88、11.27±1.93，P＜0.05)，但低、中濃度的利拉魯肽組凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，高滲組及正常糖+高濃度利拉魯肽組同正常

7、糖組比較凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(3.29±0.48、2.88±0.98vs3.33±0.32，P＞0.05)。
　　3、Westernblot結(jié)果:
　　3.1半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表達:高糖組較對正常糖組心肌細胞caspase-3表達明顯增加(P＜0.01)，高糖+利拉魯肽干預組caspase-3的表達介于對照組及高糖組之間(P＜0.01)，并與利拉魯肽濃度負相關(guān)，高濃度利拉魯肽組caspase

8、-3的表達低于低、中濃度利拉魯肽組(P＜0.01)，但低、中濃度的利拉魯肽組caspase-3表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，高滲組及正常糖+高濃度利拉魯肽組同正常糖組比較caspase-3表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3.2磷酸化P38MAPK的表達:高糖組較對正常糖組心肌細胞磷酸化P38MAPK(P-p38MAPK)表達明顯增加(P＜0.01)，高糖+利拉魯肽干預組P-p38MAPK的表達介于對照組及高糖組

9、之間(P＜0.01)，同樣與利拉魯肽濃度負相關(guān)，高濃度利拉魯肽組P-p38MAPK的表達低于低、中濃度利拉魯肽組，但低、中濃度的利拉魯肽組凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，高滲組及低糖+高濃度利拉魯肽組同正常糖組比較P-p38MAPK表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、高糖能促進SD乳鼠的心肌細胞凋亡的增加，利拉魯肽可以對抗心肌細胞凋亡。
　　2、利拉魯肽干預組較高糖組的caspase-3